结直肠癌细胞中微管结合实验：一种检测结直肠癌细胞中微管结合Tau蛋白的方法

摘要

来源：Huda, M. N.，等。结直肠癌细胞中 Tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了微管结合实验，该实验用于分离结直肠癌细胞中具有微管结合能力的tau蛋白与无结合能力的过度磷酸化tau蛋白组分。该实验有助于确定各种化学物质对tau蛋白磷酸化状态的影响，进而评估其对tau蛋白微管结合能力的作用。

方案

1. 微管结合实验

1. 进行微管结合实验时，将约 1 × 10⁶ 个 HCT 116 细胞接种至含有最低必需培养基（MEM）的 100 mm 组织培养皿中，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素。培养一天后，细胞融合度将达到 60–70%。
2. 从 4 °C 保存的 10X PEM 缓冲液中配制 1X PEM 缓冲液（2 mL），加入 20 µM（40 µL）紫杉醇和 1 mM（20 µL）GTP。从 -80 °C 冰箱中取出微管（MT）储备液，从 -20 °C 冰箱中取出大肠杆菌（E. coli）tau 工作储备液。
3. 按照表 1准备样品。
4. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。在 25 °C 下以 100,000 × g 超速离心 60 分钟。
5. 将含有未结合 tau 的上清液 120 µL 转移至洁净并标记的离心管中。
6. 向含有结合态 tau 的沉淀中加入 120 µL（与上清液体积相同）5X 上样缓冲液，并充分混匀。将溶液转移至洁净并标记的离心管中，充分混匀。
7. 使用商用蛋白检测试剂盒通过 Bradford 法测定蛋白浓度。
   注意：制备样品时，使用步骤 1.6 中的溶液体积来同时制备沉淀和上清液样品。
8. 准备等蛋白浓度的样品，并加入新配制的含 DTT（400 mM）的 4x SDS 上样缓冲液。
   注意：此阶段样品可在 -20 °C 下保存。
9. 将样品在 100 °C 的金属浴中孵育 5 分钟。使用涡旋振荡器混匀样品。室温冷却约 10–15 分钟。
10. 组装电泳系统，用于进行 10% 聚丙烯酰胺凝胶的 SDS-PAGE 电泳。
    1. 在 10% 聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入 10 µg 蛋白（13 µL 样品），并加入蛋白分子量标准。
    2. 加样后，将电泳系统的正负极连接至电源，维持恒定电压。初始以 70 V 运行 20 分钟，使蛋白样品从浓缩胶进入分离胶，随后将电压升至 125 V，继续电泳约 70–120 分钟，直至样品和蛋白标准到达凝胶底部。
    3. 电泳完成后，使用湿转法电转印系统将凝胶中的蛋白转移至 PVDF 膜上。在 100 V 下转移约 100 分钟。
    4. 通过在分子量标准一侧做一小切口标记印迹膜。使用透明塑料片和锋利刀具进行切割。
11. 用 4% BSA 封闭缓冲液在室温下封闭 膜 90 分钟。
12. 将印迹膜在一抗溶液（抗 tau 抗体，1:5,000 稀释）中 4 °C 过夜孵育。用 PBST 洗涤四次，每次 7 分钟。
13. 配制相应的二抗溶液（山羊抗小鼠 IgG，1:5,000 稀释），室温孵育 90 分钟。用 PBST 洗涤四次，每次 7 分钟。
14. 根据制造商说明，使用化学发光检测试剂盒显影印迹膜。用透明塑料膜覆盖印迹膜，使用化学发光成像系统及配套软件采集图像。

表1：微管结合实验的样品制备。

样品	名称	所需微管蛋白	所需主要蛋白	PEM-GTP-PTX
1	HCT 116-对照 (6.21 μg/μl)	2 μl	9.66 μl (60 μg)	108.34 μl
2	HCT 116-姜黄素 10 μM (4.81 μg/μl)	2 μl	16.63 μl (80 μg)	101.37 μl
3	HCT 116-姜黄素 20 μM (3.28 μg/μl)	2 μl	30.49 μl (100 μg)	87.51 μl
4	HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl)	2 μl	18.42 μl (100 μg)	99.58 μl
5	E. coli tau	2 μl	1 μl tau-352	117 μl
6	仅微管蛋白	2 μl	X	118 μl
				每份 120 μl

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HCT 116 细胞	ATCC	CCL-247
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
100 mm 培养皿	Corning	430161
Anti-Tau 13 抗体	Abcam	ab19030
二硫苏糖醇 (DTT)	Roche	10 708 984 001	储存温度 2–8 °C
微量离心机	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R
紫杉醇	Sigma-Aldrich	T1912	储存温度 2–8 °C
姜黄素	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	储存温度 2–8 °C
微管 (MT)	Cytoskeleton	MT001	4 °C 避湿保存
氢氧化钠	Sigma	72068
氯化镁	Sigma-Aldrich	M2670
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	-20 °C 保存
DPBS	WelGene	LB 001-02
超声破碎仪	Fisher Scientific	Model 500
超速离心机	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	A7906
分子成像仪	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	4 °C 保存
蛋白检测试剂染料	Bio-Rad	500-0006
α-微管蛋白 (11H10) 兔单克隆抗体	Cell signaling	2125
GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体	Cell signaling	2118
Anti-Tau (磷酸化 S396) 抗体	Abcam	ab109390
Tau-352 人源蛋白	Sigma	T 9950	-20 °C 保存
PVDF 膜	Bio-Rad	162-0177
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Affymetrix	75819
蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	500-0006	4 °C 保存
山羊抗小鼠 IgG 二抗	ThermoFisher	A-11005	4 °C 避光保存