从小鼠结直肠癌模型全血样本中分离循环肿瘤细胞：一种获取循环肿瘤细胞的方法

摘要

来源：Kochall, S.，等 结直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了一种从安乐死的结直肠肿瘤小鼠模型全血样本中分离循环肿瘤细胞的详细方案。分离得到的循环肿瘤细胞可进行培养，并用于后续预定的分析。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 从全血样本中分离循环肿瘤细胞

注意：对麻醉小鼠进行经皮心脏穿刺采血，随后实施安乐死。理想情况下，将1,000 µL血液吸入预先装有100 µL抗凝剂（乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素）的注射器中。使用抗人EpCAM（上皮细胞黏附分子）抗体来识别循环肿瘤细胞（CTC）。当小鼠模型中使用人上皮细胞系时，该方法效果良好。对于其他应用，可能需要使用不同的抗体。

1. CTC 富集：
   1. 将 15 mL 离心管预先加入 5 mL 密度梯度介质，然后小心地将血液转移至该 15 mL 离心管中。
   2. 离心（30 分钟，300 × g，无刹车），并小心移去上层上清液。
   3. 将剩余液体转移至新的 15 mL 离心管中，再次离心（15 分钟，300 × g，有刹车）。
   4. 收集含有单个核细胞的界面层（弃去其余部分），并用 PBS 洗涤细胞两次。
   5. 将细胞沉淀重悬于 200 µL PBS/1% EDTA 中，加入 4 µL EpCAM 抗体，在冰上避光孵育 20 分钟。
2. 筛选与挑取
   1. 配制以下缓冲液（下文称为挑取缓冲液）：PBS + 10% 胎牛血清（FCS）+ 1% 青霉素/链霉素（1%）+ 0.8% EDTA。
   2. 使用 PAP 笔在 6 cm 无菌培养皿内画一个约 1 cm 的圆圈（防止液体在皿内扩散），并在该圆圈内加入 700 µL 挑取缓冲液。
   3. 在圆圈内的 700 µL 挑取缓冲液中加入 50 µL 细胞悬液。在显微镜下检查细胞密度。若细胞过密，可将样品分至不同的培养皿中。
   4. 静置细胞沉降（约 5 分钟）。
   5. 在细胞悬液液滴中筛选染色阳性（即 EpCAM 阳性）的细胞。
   6. 发现目标细胞后，使用显微操作仪挑取该细胞，并将其放入 50 µL 缓冲液中，缓冲液类型根据后续分析目的而定（e.g.，RNA 提取缓冲液或培养基）。
   7. 根据后续分析目的，同时分离 EpCAM 阴性细胞和/或培养基作为阴性对照。
   8. 进行后续分析（e.g.，细胞培养、PCR）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
密度梯度介质 – Ficoll	StemCell - Lymphoprep	7801
Alexa Fluor 488 抗人 CD326 (EpCAM) 抗体，克隆株 9C4	BioLegend	324210
Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD326 (EpCAM) 抗体，克隆株 G8.8	BioLegend	118210
培养皿，60 × 15 mm，21 cm²，带通气孔	Greiner bio-one	628102
荧光细胞培养显微镜	Leica
Transferman 4r 显微操作仪	Eppendorf
CellTram Air	Eppendorf		连接至显微操作仪的负压泵
Dmz 通用微电极拉制仪	Dagan Corporation		用于制备单细胞吸取用微毛细管
Prism 玻璃毛细管	Dagan Corporation
PAP 笔	Abcam
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）	Life Technologies GmbH	14190169	挑选缓冲液
胎牛血清（FCS）	BIOCHROM AG	S 0115	挑选缓冲液
青霉素/链霉素（PenStrep）	Life Technologies GmbH	15140122	挑选缓冲液
EDTA	Roth	8040.1	挑选缓冲液
纯化抗人 CD326 (EpCAM) 抗体，克隆株 9C4	BioLegend	324201	EpCAM 免疫组织化学
HRP 标记兔抗小鼠 IgG	Abcam	ab97046	EpCAM 免疫组织化学