激光显微切割：一种从三维类器官培养模型中分离侵袭性结直肠癌细胞的技术

摘要

来源：Bullock M. 等， 结直肠癌细胞与 Ex vivo 成纤维细胞三维模型中侵袭性肿瘤微环境的分子分析。J. Vis. Exp. (2014)。

该视频展示了以微米级精度对三维类器官共培养模型进行激光显微切割的过程。在三维类器官模型中，成纤维细胞等间质成分与癌源性上皮细胞进行三维共培养。该三维模型作为一种实验工具，可在接近生理条件的环境中研究肿瘤侵袭及癌-间质相互作用。

方案

1. 组织型制备：

成纤维细胞浸润的类器官凝胶的制备：

1. 在补充有10% FCS和292 μg/ml L-谷氨酰胺的DMEM中制备成每类器官含有5 × 10⁵ 个细胞的成纤维细胞悬液。
2. 在冰上按以下比例配制类器官凝胶：
   • •  7 体积的大鼠尾胶原：Matrigel 混合液（1:1）
   • •  1 体积的过滤灭菌10× DMEM
   • •  1 体积的FCS
   • •  1 体积含有5 × 10⁵ 个成纤维细胞的细胞悬液
     配制9个凝胶（每个凝胶1 ml），共准备10 ml，轻柔混匀以避免产生气泡。
3. 将1 ml凝胶混合液加入24孔板的每孔中，在37 °C、湿润环境中孵育1小时，使凝胶凝固。1小时后，在凝胶上方加入1 ml含10% FCS的DMEM/谷氨酰胺培养基，放回培养箱过夜。
4. 次日，吸除凝胶表面的培养基，并接种1 ml含有5 × 10⁵ 个结直肠癌上皮细胞的培养基。

凝胶包被尼龙膜的制备：

5. 提前准备好已灭菌并经高压灭菌处理的尼龙膜片，尺寸为 1.5 cm × 1.5 cm。
6. 使用无菌镊子将所需数量的尼龙膜片放入 10 cm 培养皿中（通常每个培养皿可容纳 4 片尼龙膜）。
7. 在冰上按以下顺序配制凝胶（每片尼龙膜需 250 μl 总体积）：
   • •  7 份大鼠尾胶原蛋白（Rat-Tail Collagen）
   • •  1 份过滤除菌的 10 倍浓缩 DMEM（10x DMEM）
   • •  1 份胎牛血清（FCS）
   • •  1 份含 10% FCS 和谷氨酰胺的 DMEM（DMEM 10% FCS/Glut）
8. 若溶液呈黄色，需逐次加入 50 μl 的 0.1 M NaOH 进行中和，直至溶液变为粉红色。
9. 在每片尼龙膜上加入 250 μl 该溶液，置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育 30 分钟，使凝胶充分凝固。
10. 用 PBS 配制 1% 戊二醛溶液。待凝胶凝固后，向每个 10 cm 培养皿中加入 10 ml 该溶液，并在 4 °C 下孵育 1 小时。
11. 将尼龙膜用 PBS 洗涤 3 次，再用含 10% FCS 的 DMEM/谷氨酰胺（DMEM/Glu）洗涤 1 次，随后在 4 °C 的 DMEM/Glu 溶液中过夜孵育。

将类器官凝胶置于钢网上以诱导侵袭：

12. 通过将不锈钢片折叠成三脚架形状，预先制备支架网格。使用前进行高压灭菌。
13. 使用经乙醇灭菌的镊子将钢网放入六孔板的每个孔中。
14. 将胶原层朝上的明胶包被尼龙膜放置在每个支架网格上。
15. 使用经乙醇灭菌的刮铲，小心地将类器官凝胶从24孔板转移至抬高的尼龙膜上。
16. 向孔中加入含10% FCS补充的DMEM 10% FCS/Glut培养基，直至尼龙膜与培养基接触但未浸没。确保培养基不接触类器官凝胶。
17. 在37 °C、5% CO₂的湿润环境中孵育14天，每2天更换一次培养基。

2. 器官型固定

1. 取出包含尼龙膜的整个器官型组织，并置于保鲜膜上。
2. 使用洁净的一次性手术刀将器官型组织及尼龙膜沿中线切开，将两半组织在室温下用甲醛固定24小时。
3. 24小时后，用70%乙醇替换甲醛，过夜放置，随后进行石蜡包埋、切片和染色。

3. 侵袭边缘的激光显微切割

1. 将组织切片至10 μm厚度，切片至膜载玻片上。
2. 加入二甲苯处理1分钟以脱蜡，随后去除二甲苯，并用75%乙醇固定1分钟。
3. 去除乙醇，加入0.125%焦油紫（Cresyl Violet）溶液染色1分钟。焦油紫可标记上皮细胞，便于与间质组织清晰区分。
4. 去除焦油紫溶液，加入100%乙醇处理1分钟，再用100%乙醇漂洗。将玻片置于空气中干燥30分钟。
5. 使用选定的平台进行激光显微切割（e.g., Leica AS系统）。
6. 将带有染色切片的玻片正面朝下放置于显微镜载物台上。
7. 将0.5 ml微量离心管装入收集盒中，并在管盖内加入50 μl细胞裂解缓冲液（e.g., DNA、RNA或蛋白裂解缓冲液），用于收集显微切割后的组织。
8. 在直接视野下，使用操纵杆定位目标组织。通过软件界面标注染色的组织切片，标记肿瘤浸润前沿需进行显微切割的细胞区域。
9. 启动激光，激光将切割所标记的区域，并将切割下的组织弹射至微量离心管的管盖中。
10. 当收集到足够量的组织后，取出收集盒，盖上微量离心管并轻轻离心，使裂解缓冲液沉至管底。
11. 将样品置于冰上直至显微切割完成。采用适当方法对样品进行处理，以提取目标分析物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结直肠癌细胞系——示例为 SW480	ATCC	ATCC CCL-228
胶原蛋白	BD 生物科学	354265
Matrigel	BD 生物科学	354234
尼龙膜	默克密理博	VVLP01300
金属网格	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
激光显微切割平台	徕卡显微系统	Leica AS LMD
膜载玻片	分子器件公司
焦宁 Violet	默克密理博	1052350025