牵引力显微镜检测：一种量化癌细胞在细胞外基质上施加牵引力的方法

摘要

来源：Ali, M. Y.，等。 从手术组织中分离原代人结肠肿瘤细胞并将其直接培养在软弹性基底上用于牵引力显微镜分析。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频介绍了牵引力显微镜检测方法。该检测用于测定人结肠癌细胞在含有嵌入式荧光微球的软性弹性水凝胶上的细胞牵引力，其中水凝胶表面含有细胞外基质。通过适当的软件测量荧光微球产生的位移。

方案

1. 牵引力显微镜检测

1. 将0.25%胰蛋白酶-EDTA/10% SDS溶液在37 °C水浴中预热10分钟，然后开始牵引实验。
2. 一次从细胞培养孵箱中取出一块凝胶（用细胞外基质分子人纤维连接蛋白以50 µg/ml的浓度功能化PA凝胶和玻璃），置于倒置荧光显微镜载物台上（32倍放大）。
3. 在视野中找到一个单细胞。移去培养皿盖。
4. 拍摄细胞的相差图像（例如, 图1).
5. 切换成荧光成像模式并选择合适的滤光片。在此期间不要移动显微镜载物台或样品。
6. 拍摄细胞牵引力位移的荧光微球图像图2C).
7. 向培养皿中加入1 ml胰蛋白酶/SDS溶液，以使细胞从凝胶上脱离。在此期间，不要移动显微镜载物台或样品。同时，拍摄细胞的对照图像，以确认细胞已完全从凝胶上移除。
8. 细胞移除后，采集珠子的参考（零力）图像。
9. 对所有其他凝胶重复步骤 1.2–1.8。
10. 使用 ImageJ 将每种情况下在步骤 1.6 和 1.8 中获取的两幅图像生成图像堆栈。在 ImageJ 中打开图像后，依次执行以下命令以生成图像堆栈：图像 → 堆栈 → 图像到堆栈。
11. 为了获得位移场和牵引力，请按照已发表的方法使用 ImageJ 插件。通过以下链接获取这些插件的代码和详细教程：https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins。
    1. 使用“模板匹配”（Template Matching）插件对图像堆栈进行对齐。在 ImageJ 中打开步骤 1.10 生成的图像堆栈后，依次执行以下命令：插件 → 模板匹配 → 对齐堆栈切片 → 确定。随后保存该图像堆栈。后续步骤中使用此新的图像堆栈。
    2. 使用PIV（粒子图像测速）插件获取位移场 （图2D））。在打开第1.11.1步保存的图像序列后，依次执行以下命令：Plugins → PIV → Iterative PIV (Basic) → OK → Accept this PIV and output → Ok。将PIV输出结果保存至与原始图像序列相同的目录中，并在下一步中将其作为输入文件使用。
    3. 最后，使用 FTTC（傅里叶变换牵引力显微镜）插件获取牵引力图谱 （图2E）使用以下命令序列：插件 → FTTC → 插入材料属性，即PA凝胶的杨氏模量和泊松比 → 确定 → 选择步骤1.11.2中保存的PIV输出文件 → 确定。将FTTC结果保存至与图像堆栈和PIV输出文件相同的目录中。

结果

图1. 人原代结肠细胞（包括癌变和正常细胞）在不同刚度凝胶及聚苯乙烯培养皿上的成功培养。 相差显微图像显示了（A）肿瘤细胞和（B）正常细胞在不同刚度基质上的典型形态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Lonza	17-516F
胰蛋白酶	Worthington	LS003736
丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A4058
N-亚甲基双丙烯酰胺（bis）	Sigma-Aldrich	M1533
人纤维连接蛋白	BD biosciences	354008
0.1 µm 荧光微球	Life technologies	F8801
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Life technologies	25200-056
12 mm<sup>2</sup> 玻璃盖玻片	Corning	2865-12