牵引细胞术测定:一种量化癌细胞对 ECM 施加的牵引力的方法

Abstract

来源:Ali， BY 等人 从手术组织中分离原代人结肠肿瘤细胞并将其直接在柔软的弹性基质上培养用于牵引细胞术。J. Vis. Exp. （2015 年）。

该视频介绍了牵引力显微镜检查。该测定法确定人结肠癌细胞对存在于具有嵌入荧光珠的软弹性水凝胶上的细胞外基质的细胞牵引力。使用适当的软件测量荧光珠的所得位移。

Protocol

1. 牵引力显微镜检测

1. 牵引实验开始前，将 0.25% 胰蛋白酶-EDTA/10% SDS 溶液在 37 °C 的水浴中加热 10 分钟。
2. 一次从细胞培养箱中取出一块凝胶（用 ECM 分子、浓度为 50 μg/ml 的人纤连蛋白功能化 PA 凝胶和玻璃），并置于荧光倒置显微镜载物台上（放大 32 倍）。
3. 在视野中查找单个单元格。取下培养皿盖。
4. 拍摄细胞的相差图像（例如，图 1）。
5. 将成像模式切换为荧光并选择合适的滤光片。在此期间，请勿移动显微镜载物台或样品。
6. 拍摄被细胞牵引取代的荧光珠的图像（图 2C）。
7. 向培养皿中加入 1 ml 胰蛋白酶/SDS 溶液，以将细胞从凝胶中分离。在此期间，请勿移动显微镜载物台或样品。此外，拍摄细胞的对照图像以确保从凝胶中完全去除。
8. 去除细胞后拍摄微珠的参考（零力）图像。
9. 对所有其他凝胶重复步骤 1.2-1.8。
10. 对于每种情况，使用 ImageJ 从步骤 1.6 和 1.8 中采集的两张图像中制作图像堆栈。要生成图像堆栈，请在打开图像后在 ImageJ 中使用以下命令序列:Image → Stacks → Images to stack.
11. 要获得位移场和牵引力，请按照已发布的方法使用 ImageJ 插件。使用以下链接获取这些插件的代码和详细教程:https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins。
    1. 使用 'Template Matching' 插件对齐堆栈中的图像。打开步骤 1.10 中生成的图像堆栈后，在 ImageJ 中使用以下命令序列:插件→模板匹配 → 对齐堆栈中的切片 → 确定。在以下步骤中使用此新映像堆栈。
    2. 使用 PIV（粒子图像测速）插件获取位移场（图 2D）。打开步骤 1.11.1 中保存的图像堆栈后，使用以下命令序列:→ PIV 的插件 → 迭代 PIV （Basic） → 确定 → 接受此 PIV 并输出 → 确定。将 PIV 输出保存在与原始图像堆栈相同的目录中。将此用作下一步的输入。
    3. 最后，使用 FTTC（傅里叶变换牵引细胞术）插件获取牵引图（图 2E）。使用以下命令序列: FTTC →插件 → 插入材料属性，即 PA 凝胶的杨氏模量和泊松比 → 确定 → 选择步骤 1.11.2 中保存的 PIV 输出文件 → 确定。将 FTTC 结果保存在与图像堆栈和 PIV 输出相同的目录中。

Results

图 1.在不同刚度的凝胶和聚苯乙烯培养皿上成功进行原代人结肠细胞培养（癌症和正常）。相差图像显示了 （A） 肿瘤细胞和 （B） 正常细胞在不同刚度基材上的典型形态。

图 2.（A） H & E 染色确认浸润性腺癌。（B） 纤连蛋白染色显示凝胶均匀地包被 ECM 分子。（C） 嵌入凝胶内的纳米级珠子作为受托标记物。（D） 如 1.11.2 中所述，使用 ImageJ 中的 PIV 插件，肿瘤细胞在软 PA 凝胶上产生的代表性位移场。...

Materials