细胞骨架与黏着斑组织检测：一种基于免疫荧光的细胞在基质上黏附与铺展研究方法

摘要

来源：Ali, M. Y 等， 从手术组织中分离原代人结肠肿瘤细胞并在软弹性基底上直接培养用于牵引力细胞测量术。J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了研究原代人结肠癌细胞中细胞骨架和黏着斑的技术，以了解其随基质刚度变化的差异。通过在软硬基质上培养癌细胞，可进行多种下游生物物理测量，用于癌症预后评估。

方案

1. 免疫荧光显微镜检测

1. 将带有待进行免疫染色细胞的基质转移至超净工作台，并移除培养基。
2. 用 PBS 清洗基质，并用含 4% 多聚甲醛的 PBS 在室温下固定细胞 20 分钟。
3. 用 PBS 洗涤基质三次（每次 5 分钟）。随后，将基质与 500 µl 信号增强剂在室温下孵育 30 分钟，再用 PBS 冲洗。
4. 将细胞与单克隆抗vinculin抗体以 1:250 的比例溶于 PBS 中，在室温下孵育 45 分钟。然后，用 PBS 洗涤基质三次（每次 5 分钟）。
5. 将样品与 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗以 1:200 的比例溶于 PBS 中，在室温下孵育 30 分钟。再用 PBS 洗涤基质三次（每次 5 分钟）。
6. 为观察 F-肌动蛋白结构，将细胞与 TRITC 标记的鬼笔环肽结合物在 50 µg/ml 浓度下于室温孵育 45 分钟。然后，用 PBS 洗涤基质三次（每次 5 分钟）。
7. 使用共聚焦激光扫描显微镜对样品进行成像（图 1A–1D）。

结果

图1. 软凝胶与硬质聚苯乙烯基底上F-肌动蛋白和连环蛋白的免疫荧光染色。 在软的2 kPa凝胶上，形态较少伸展的（A1）肿瘤细胞或（A2）正常细胞中均未见肌动蛋白纤维。然而，在软凝胶上可见含有连环蛋白的点状局灶性黏附结构（B1-B2）。相反，在刚性聚苯乙烯基底上，原代细胞呈现充分伸展的形态、清晰的肌动蛋白应力纤维（C1-C2），以及离散的、拉长的局灶性黏附结构（D1-

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>试剂</strong>
PBS	Lonza	17-516F
多聚甲醛&nbsp;&nbsp;	Electron Microscopy Sciences	RT15710
信号增强剂	Life technologies	I36933
单克隆抗粘连蛋白抗体&nbsp;&nbsp;	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG&nbsp;&nbsp;	Life technologies	A11001
TRITC-鬼笔环肽偶联物&nbsp;&nbsp;	Sigma-Aldrich	P1951
<strong>材料</strong>
12 mm² 玻璃盖玻片&nbsp;&nbsp;	Corning	2865-12