Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: An Immunofluorescence-based Method to Study Cell Adhesion and Spreading on Substrates

doi:10.3791/20345

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Research Article

细胞骨架和黏着斑组织测定:一种基于免疫荧光的研究细胞粘附和在底物上扩散的方法

April 30, 2023

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Abstract

来源:Ali， M. Y et al.，从手术组织中分离原代人结肠肿瘤细胞并将其直接在柔软的弹性基质上培养用于牵引细胞术。J. Vis. Exp. （2015）

该视频介绍了研究原代人结肠癌细胞中的细胞骨架和黏着斑的技术，以了解其根据基质刚度的变化。这种在软质和硬质基质上培养癌细胞的这种方式允许对癌症预后进行各种下游生物物理测量。

Protocol

1. 免疫荧光显微镜检测

将带有待免疫染色细胞的底物带到层流罩中，并去除培养基。
用 PBS 冲洗底物，并在室温下用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。
用 PBS 洗涤底物 3 次（每次 5 分钟）。因此，将底物与 500 μl 信号增强剂孵育 30 分钟，然后用 PBS 冲洗。
在 RT 下，将细胞与 PBS 中 1:250 稀释的单克隆抗黏着斑蛋白抗体孵育 45 分钟。然后，用 PBS 洗涤底物 3 次（每次 5 分钟）。
将样品与 PBS 中以 1:200 稀释的二抗 Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG 在 RT 下孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤底物 3 次（每次 5 分钟）。
为了可视化 F-肌动蛋白结构，在 RT 下将细胞与 TRITC 鬼笔环肽偶联物以 50 μg/ml 的浓度孵育 45 分钟。然后，用 PBS 洗涤底物 3 次（每次 5 分钟）。
使用共聚焦扫描激光显微镜对样品进行成像（图 1A-1D）。

Representative Results

图 1
图 1.F-肌动蛋白和黏着斑蛋白在软凝胶和硬聚苯乙烯基材上的免疫荧光染色。在软 2 kPa 凝胶上，扩散较少的（A1）肿瘤细胞或（A2）正常细胞中不存在肌动蛋白纤维。然而，含点状黏着斑的黏着斑存在于软胶囊（B1-B2）上。相反，原代细胞在刚性聚苯乙烯基材上表现出分布良好的形态、明确的肌动蛋白应力纤维（C1-C2）和离散的细长粘附着斑（D1-D2）。

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 试剂 PBS 系列龙沙 17-516F 多聚甲醛电子显微镜科学 RT15710 信号增强器生命科技编号 I36933 单克隆抗黏着斑蛋白抗体西格玛-奥德里奇 V9131 系列 Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG 生命科技编号 A11001 TRITC 鬼笔环肽偶联物西格玛-奥德里奇 P1951 材料 12 mm2 玻璃盖玻片康宁 2865-12

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