小鼠背部皮肤黑色素瘤样本的冻存皮肤组织块制备方案

摘要

来源：Moon, H.，等。 利用突变型黑色素细胞干细胞实现小鼠黑色素瘤发生的时空控制。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了分离含有黑色素瘤的小鼠背部皮肤并进行冷冻包埋以制备冷冻皮肤组织块的详细实验方案。该冷冻包埋的组织块可切片后进行显微镜检查，用于研究黑色素瘤的进展过程。

方案

所有涉及动物的实验程序均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 组织处理

1. 皮肤分离
   1. 开始前准备好以下物品：解剖器械、滤纸和纸巾。
   2. 根据批准的方案处死小鼠，并在继续操作前确认动物死亡。
   3. 使用毛发修剪器剃除背部皮肤区域的毛发，然后用无绒组织轻轻擦拭该区域以清洁表面。
   4. 用锋利的剪刀在尾部基部稍上方做一个小切口。
   5. 将大型钝头剪刀插入切口，分离皮下结缔组织。
   6. 沿组织边缘用锋利的剪刀小心地分离出目标皮肤区域。
   7. 将皮肤组织放置在干净的纸巾上，用钝头镊子拉伸皮肤，使其贴附于纸巾并保持紧绷。此步骤可为组织提供额外支撑，便于后续操作和处理，同时维持其形态。
      注意：操作时应仅接触皮肤组织的外围区域，因为镊子可能对皮肤造成损伤，这种损伤可在组织学检查中观察到。
2. 组织固定
   1. 将一张滤纸对折并做好相应标记。将带有纸巾衬底的皮肤样本紧贴折痕处放入折叠的滤纸中，确保样本平整，无折叠或皱褶。用订书钉封好滤纸开口的两侧，然后修剪多余部分，以便剩余滤纸可用于后续样本。
      注意：此步骤旨在使皮肤在固定过程中保持原有形态。
   2. 将组织样本完全浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定3至5小时，或在4 °C下过夜。
   3. 固定完成后，从福尔马林中取出样本，用去离子水洗涤（每次5分钟，共2次），然后进行制块。仔细清除皮肤组织上的残留物（如残余纸张）。
3. 制备冷冻组织块 （图1）
   1. 修剪皮肤样本边缘，使其平滑无毛刺，然后进行3次矢状切口。这些条带的宽度不应超过冷冻模具的高度（5 mm）。接着进行横向切割，使皮肤片段长度不超过冷冻模具的宽度（20 mm），以便包埋。对剩余半片背部皮肤重复此操作，或将其保存用于其他用途（也可选择在固定前保存一半组织）。
      注意：必须保持皮肤片段的正确方向。
   2. 将冷冻模具（25 x 20 x 5 mm³）竖直放置，向OCT包埋剂表面放置4至5片皮肤。待所有片段就位后，使用两对精细镊子将皮肤的长边向下调整至模具底部。此时皮肤应垂直立于OCT中，与模具底面垂直。在此过程中需尽量减少OCT内气泡的形成 （图1）。
   3. 向模具中加入OCT至第二层边缘，然后将其置于干冰的平坦表面上。使用镊子在组织块开始冻结时调整可能移位的皮肤片段。一旦底层凝固，将无法再对组织进行操作。
   4. 切取8-10 µm厚的切片用于分析。
4. 制备福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块
   1. 将两片固定后的皮肤放入标记好的组织盒中，依次通过浓度递增的乙醇脱水（75%乙醇30分钟，85%乙醇30分钟，90%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇两次，每次30分钟，二甲苯或二甲苯替代物两次，每次30分钟）。随后在58-60˚C下孵育石蜡，先30分钟，再过夜。
   2. 将组织包埋于24 x 24 mm²不锈钢组织模具中的液态石蜡中，并在-5 °C下固化。组织方向应与冷冻组织块相似，以便观察跨越多个毛囊的纵向切面 （图1）。
   3. 待石蜡完全固化后，取出模具并切取5-10 μm厚的切片用于分析。

结果

图1：皮肤组织的分离与冷冻包埋。安乐死后，剃除小鼠背部目标区域的毛发，并将皮肤置于含有OCT的冷冻模具中进行包埋。图中小鼠身上的虚线表示中线。通常可沿中线分离出3至4块皮肤，编号为3-4的线段即代表其中之一；其中一块由矩形1/2/3/4标示。这些皮肤样本应如图所示包埋于OCT中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
宠物毛发修剪器	Wahl	09990-502
脱毛膏	Nair	n/a	大多数药店有售
棉签	各种品牌
紫外灯泡	UVP	95-0042-08	型号 XX-15M 中波段紫外灯
200 证明乙醇	各种品牌		纯乙醇
Histoplast PE	费希尔科技	22900700	石蜡颗粒
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma	HT501128-4L
O.C.T. 包埋剂	Thermo	23730571
组织包埋盒	Sakura	89199-430	用于 FFPE 处理
冷冻模具	Sakura	4557	25 × 20 mm
FFPE 金属模具	Leica	3803082	24 mm × 24 mm
异氟烷	各种品牌		兽用级
麻醉吸入系统	各种品牌		兽用级
精细剪刀	FST	14085-09	直头，锐/锐
精细剪刀	FST	14558-09	直头，锐/锐
镊子	FST	11252-00	Dumont #5
镊子	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	7914	ai14