患者来源的异种移植模型构建：一种生成黑色素瘤小鼠模型的技术

摘要

来源：Min Xiao 等。 黑色素瘤患者来源的异种移植模型。 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，将来源于人类的黑色素瘤细胞皮下植入免疫缺陷小鼠的 flank 区域。PDX 模型可实现对黑色素瘤细胞的临床前研究，更好地重现 in vivo 条件下观察到的肿瘤异质性和黑色素瘤侵袭性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 用于小鼠移植的肿瘤组织处理

1. 手术切除或手术活检组织处理
   1. 将组织转移至无菌培养皿中，并尽可能将肿瘤组织与周围正常组织分离。
   2. 尽可能去除坏死组织（通常为位于肿瘤中央的苍白或灰白色组织）。
   3. 使用手术刀将初始肿瘤组织块切割成大小相近的片段（约 3 mm × 3 mm），用于小鼠手术植入（图1）。
   4. 可选：若肿瘤组织充足，可将部分组织速冻，用于后续检测（如RNA测序 [RNASeq]、全外显子组测序 [WES] 等）。
   5. 使用两把手术刀片采用交叉切割法将肿瘤组织切碎，制成匀浆；尽可能将肿瘤块切碎以形成匀浆，该匀浆即可用于小鼠手术植入。
   6. 或者，若肿瘤组织过于坚硬而难以机械解离，可采用消化解离法，制备凝胶状匀浆及单细胞悬液，用于植入和/或注射。
      1. 尽可能将肿瘤块切碎，形成匀浆。
      2. 将匀浆放入50 mL离心管中，加入冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS^-/-）（不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺）；在4 °C下以220 × g离心4分钟。
      3. 每1 g肿瘤组织加入10 mL预热的新鲜消化液（含200 U/mL IV型胶原酶 + 5 mM CaCl₂ + 50 U/mL DNase的HBSS^-/-），重悬匀浆。
      4. 将离心管置于37 °C水浴中20分钟，每隔5分钟用一次性移液管剧烈混匀一次。
      5. 用最多50 mL HBSS^-/-洗涤；然后在4 °C下以220 × g离心4分钟。
      6. 每1 g肿瘤组织加入5 mL预热的TEG溶液（含0.025%胰蛋白酶 + 40 µg/mL乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸 [EGTA] + 10 µg/mL聚乙烯醇 [PVA]），轻轻重悬或振荡，将离心管置于37 °C孵育2分钟，期间不混合。
      7. 加入至少等体积的冷染色液（含1%牛血清白蛋白 [BSA] + 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 [HEPES] + 1×青霉素-链霉素的L15培养基）以终止胰蛋白酶反应，并在4 °C下以220 × g离心4分钟。
      8. 每1 g肿瘤组织用10 mL染色液重悬样本，并通过40 µm细胞筛过滤，获得用于小鼠注射的单细胞悬液（图1）。
      9. 细胞筛上残留的匀浆也可收集，用于小鼠手术植入。
2. 小鼠肿瘤植入与注射
   1. 手术切除或手术活检组织的植入
      注意：确保所有手术器械通过高压灭菌或使用预灭菌一次性器械进行无菌处理。
      1. 剃除6-8周龄NSG雄性或雌性小鼠背部下方的毛发，保留约1.5 cm × 3 cm的无毛区域。使用异氟烷麻醉小鼠，并通过轻捏足部测试反应性以确认麻醉效果。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
      2. 将小鼠置于麻醉机鼻罩内的加热垫上，用氯己定擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇浸润并待其自然挥发。
      3. 在培养皿中将肿瘤组织块或匀浆分成若干独立小堆，用于手术植入（例如，若需植入3只小鼠，则分为三等份）。
      4. 使用手术刀片在小鼠背部中央做约5 mm长的切口，用一对镊子提起切口对侧的皮肤（远离操作者一侧）。
      5. 另一手持剪刀，通过小幅度剪切筋膜层，将皮肤与肌肉层分离，从而形成一个容纳肿瘤组织的"皮下袋"。
      6. 用手术刀片挑取一块肿瘤组织或一份匀浆小堆，轻轻置入已形成的皮下袋中。
      7. 向皮下袋内的肿瘤组织小堆上加入100 µL人工细胞外基质。
      8. 使用两对镊子将切口两端拉拢，使伤口边缘紧密贴合，并使用一至两个伤口夹闭合切口。
      9. 术后通过皮下注射给予小鼠1–5 mg/kg美洛昔康作为镇痛剂。
      10. 将小鼠从鼻罩中取出并放回原笼，观察其苏醒过程；在完全恢复前不得与其他小鼠合笼。
      11. 约7天后拆除伤口夹。若7天后伤口未完全愈合，可继续保留伤口夹一至两天。
          注意：若使用来自手术切除或手术活检组织处理所得的单细胞悬液，则需与人工细胞外基质按1:1比例混合后用于小鼠注射。
   2. FNA或穿刺活检组织的注射
      1. 将NSG小鼠置于金属网格架上，用非优势手牢固抓住其尾部，轻轻向后拉，使其前肢紧握网格。或者，也可用手固定小鼠，使其侧腹区域暴露。
      2. 用酒精棉片消毒侧腹部皮肤。缓慢而稳定地将注射器内容物注入小鼠皮下。
      3. 拔出针头，将小鼠放回笼中。
3. 监测肿瘤生长
   1. 每周监测一次小鼠，检查是否有可触及的肿瘤。
   2. 当肿瘤达到可测量大小（约50 mm³）时，使用游标卡尺记录肿瘤尺寸。采用以下公式计算肿瘤体积：（宽度 × 宽度 × 长度）/ 2。
   3. 当肿瘤体积达到约1.5 cm³时（约4–10周），收获肿瘤。此时的肿瘤称为第一代小鼠传代肿瘤（MP1）。

结果

图1：不同的移植方法。 (A) 肿瘤组织可被处理为组织块、匀浆悬液或单细胞悬液。(B) 三种方法均可实现在体内的肿瘤生长。图中显示的是皮下接种肿瘤组织的小鼠在移植后第12天的成像结果。(C) 显示的是采用三种移植方法之一注射的小鼠肿瘤生长曲线。每组 N = 5；误差线表示标准误。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x 青霉素-链霉素溶液（PenStrep） 	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/-（不含 Ca++ 或 Mg++）	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% 胰蛋白酶（Trypsin） 	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	分装为 10 mL 每份，于 –20°C 保存
牛血清白蛋白（BSA）	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
氯己定（Chlorhexidine）	菲舍尔科技公司（Fisher Scientific）	Cat# 50-118-0313
IV 型胶原酶（Collagenase IV，2,000 u/mL）	沃辛顿公司（Worthington） 	Cat #4189	使用 IV 型胶原酶粉末储备液（Worthington #4189，每毫克单位数见瓶身标注，随批次变化）溶于 HBSS-/- 配制；分装后冷冻保存
二甲基亚砜（DMSO）	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
脱氧核糖核酸酶（DNase）	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid）	默克公司（Merck）	Cat # 324626.25
胎牛血清（FBS）	英潍捷基生命技术公司（INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES）	Cat # 16000-044
两性霉素 B（Fungizone）	英潍捷基生命技术公司（INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES）	Cat # 15290-018
庆大霉素（Gentamicin）	菲舍尔科技公司（FISHER SCIENTIFIC）	Cat # BW17518Z
异氟烷（Isoflurane）	亨利·谢恩动物健康公司（HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH）	Cat # 050031
Leibovitz L15 培养基 	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	康宁公司（Corning）	Cat # 354230	人工细胞外基质
美洛昔康（Meloxicam）	亨利·谢恩动物健康公司（HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH）采购编号 ::Henry Schein	Cat # 025115	剂量 1–5 mg/kg，用作镇痛药
NOD/SCID/IL2 受体缺失（NSG）小鼠	沃斯塔研究所动物设施（The Wistar Institute, animal facility）		繁殖用
聚乙烯醇（PVA，polyvinyl alcohol）	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 培养基（改良型，1×，含 L-谷氨酰胺）	菲舍尔科技公司（Fisher Scientific）	Cat# MT10041CM
手术刀片	Feather	Cat # 2976-22
伤口夹	MikRon	Cat #427631