患者来源的异种移植物建模:一种生成黑色素瘤小鼠模型的技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 小鼠植入的肿瘤组织处理

1. 手术切除或手术活检组织处理
   1. 将组织转移到无菌培养皿中，并尽可能将肿瘤组织与周围的正常组织分开。
   2. 尽可能从剩余的肿瘤中去除坏死组织（通常被确定为位于肿瘤中央的淡白色组织）。
   3. 使用手术刀将初始肿瘤块细分为大致相等的块 （~3 mm x 3 mm），用于手术小鼠植入（图 1）。
   4. 或者，如果有足够的肿瘤组织可用，则快速冷冻组织以进行下游检测（RNA 测序 [RNASeq]、全外显子组测序 [WES] 等）。
   5. 通过使用带有两个手术刀刀片的十字刀片技术将肿瘤组织切碎来制备肿瘤浆液。将肿瘤块尽可能细地切碎以形成浆液，现在可以进行手术小鼠植入。
   6. 或者，如果肿瘤组织太硬而无法机械解离，则使用消化解离程序形成凝胶状浆液和用于植入和/或注射的单细胞悬液。
      1. 将肿瘤块尽可能细地切碎以形成浆液。
      2. 将浆液放入装有冷汉克平衡盐溶液 （HBSS） ^-/-（不含 Ca⁺⁺ 和 Mg⁺⁺）的 50 mL 管中;然后，在 4 °C 下以 220 x g 离心沉淀 4 分钟。
      3. 每 1 克肿瘤组织将浆液重悬于 10 mL 加热的新鲜消化培养基（200 U/mL 胶原酶 IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U/mL DNase 的 ^HBSS-/-）中。
      4. 将试管置于 37 °C 水浴中 20 分钟，并用一次性移液器每 5 分钟剧烈混合一次。
      5. 用多达 50 mL 的 HBSS^-/-洗涤;然后，在 4 °C 下以 220 x g 离心 4 分钟。
      6. 每 1 g 肿瘤组织加入 5 mL 预热的 TEG（0.025% 胰蛋白酶 + 40 μg/mL 乙二醇-双（β-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 [EGTA] + 10 μg/mL 聚乙烯醇 [PVA]），轻轻重悬/摇动，并将试管在 37 °C 下放置 2 分钟，不要混合。
      7. 加入至少 1 等体积的冷染色培养基（1% 牛血清白蛋白 [BSA] + 10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 [HEPES] + 1x 青霉素-链霉素在 L15 培养基中）以淬灭胰蛋白酶，并在 4 °C 下以 220 x g 离心 4 分钟。
      将
      8. 样品重悬于每 1 克肿瘤组织 10 mL 染色培养基中，并通过 40 μm 细胞过滤器过滤，以获得用于小鼠注射的单细胞悬液（图 1）。
      9. 也可以收集留在细胞过滤器顶部的浆液，用于外科小鼠植入。
2. 小鼠肿瘤植入和注射
   1. 植入手术切除或手术活检组织
      注意:通过高压灭菌或使用预先消毒的一次性器械，确保所有手术器械都是无菌的。
      1. 从 NSG 6-8 周龄雄性或雌性小鼠的下背部剃除毛发，留下大约 1.5 cm x 3 cm 的无毛区域。使用异氟醚麻醉小鼠，并通过轻轻挤压脚来确认作为反应性的测试。在他们的眼睛上使用兽医药膏以防止干燥。
      2. 将单只小鼠放在麻醉机鼻锥的加热垫上，用洗必泰擦洗剃须区域。然后，用 70% 乙醇浸泡并使其蒸发。
      3. 在培养皿中准备块或将肿瘤浆液分成单独的土丘进行手术植入（即，如果要植入 3 只小鼠，则分成三个相等的土丘）。
      4. 使用手术刀刀片，在鼠标背面中心切开一个约 5 毫米长的切口，取一把镊子，抬起切口对面的皮肤。
      5. 将剪刀拿在另一只手里，用小剪刀轻轻剪断筋膜，将皮肤与肌肉层分开，从而为肿瘤组织创建一个"口袋"。
      6. 用手术刀刀片拾取一个肿瘤块或一个单独的肿瘤浆组织堆，然后轻轻地将组织放入创建的口袋中。
      7. 在口袋中的肿瘤组织丘上施用 100 μL 人工细胞外基质。
      8. 使用两对镊子，拉起两端的切口，使伤口边缘靠拢，然后通过应用一个或两个伤口夹来闭合伤口。
      9. 手术后皮下注射 1-5 mg/kg 美洛昔康作为小鼠的镇痛药。
      10. 将鼠标从鼻锥中取出，然后将其放回原来的笼子中;醒来时观察鼠标。在完全恢复之前不要返回笼子。
      11. 大约 7 天后取下伤口夹。如果 7 天后仍未完全愈合，请将伤口夹再放置一两天。
          注意:如果使用手术切除或手术活检组织处理的单细胞悬液，它将与人工细胞外基质（以 1:1 的比例）混合用于小鼠注射。
   2. 注射 FNA 或粗针活检组织
      1. 将 NSG 鼠标放在钢网格机架上，牢牢握住鼠标的尾部，然后轻轻地将鼠标向后拉。它会用前腿牢牢抓住网格。或者，将鼠标限制在非惯用手中，并让侧面区域可见。
      2. 用酒精制备拭子对侧腹皮肤进行消毒。缓慢而稳定地将注射器的内容物注射到小鼠的皮肤下。
      3. 拔出指针并将鼠标放回其笼中。
3. 监测肿瘤生长
   1. 每周监测小鼠一次以检查可触及的肿瘤。
   2. 一旦肿瘤达到可测量的大小（约 50 mm³），使用卡尺记录肿瘤尺寸。使用以下公式计算肿瘤体积:（宽 x 宽 x 长） / 2。
   3. 一旦肿瘤体积达到约 1.5 cm³（约 4-10 周），就收获肿瘤。这种肿瘤现在称为小鼠传代 1 （MP1）。

图 1:替代植入方法。（A） 肿瘤可以加工成块状、浆状悬浮液或单细胞悬浮液。（B） 所有三种方法都将允许肿瘤在体内生长。这里显示的是皮下植入肿瘤并在植入后 12 天成像的小鼠。（C） 显示了注射三种植入方法之一的小鼠的肿瘤生长曲线。N = 每只手臂 5 个;误差线为标准误差。