悬滴法：一种生成三维黑色素瘤球体的技术

摘要

来源：Müller, I. 等，一种三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型。J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了利用黑色素瘤细胞通过悬滴法生成三维球状体的技术。所生成的 体外 三维（3D）类器官黑色素瘤球状体模型 可以描绘出 体内 恶性黑色素瘤的结构可能为肿瘤内部相互作用提供见解。 

方案

1. 通过悬滴法生成三维黑色素瘤球体 Via 悬滴法

1. 培养黑色素瘤细胞（例如，451-LU 或任何感兴趣的黑色素瘤细胞系）按照通用方案，使用含 10% FCS 的 RPMI 培养基进行培养。
   1. 为生成大小和质量相似的黑色素瘤类球体，用 PBS 洗涤黑色素瘤细胞，向 T175 培养瓶中的细胞加入 5 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA（溶于 PBS），室温（RT）孵育 3–5 分钟。加入 5 mL RPMI/10% FCS 以中和胰蛋白酶。在 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。根据血细胞计数板计数结果，将细胞沉淀重悬于 RPMI/FCS 中，终浓度为 10,000 个细胞/mL。
2. 点样 40 x 25 µ将细胞悬液中的 L（= 250 个细胞）接种至无菌非黏附性细胞培养皿盖的内表面Ø 使用电子多通道移液器将10 cm）的细胞培养皿中。以快速但平稳的动作将盖子翻转并放置在含有5 mL PBS的相应细胞培养皿上。
   1. 培养 "悬滴培养皿" 在37℃的细胞培养箱中 °C 和 5% CO₂₂ 10至14天，具体时间取决于所使用的细胞类型。
      注意： 转移性黑色素瘤生长期的细胞在悬滴法中通常比来自径向生长期或垂直生长期的黑色素瘤细胞生长更快，并形成更致密的球状体。对于单个评估，可在双目镜或光学显微镜（4倍）下观察球状体的生长情况。 放大倍数下）。通常，在双目镜或光学显微镜（4X）下，类球体在48小时后即可被观察到。 放大倍数）。10-14天后，无需任何放大设备即可观察到。
3. 初始滴加五天后，加入10 µL 新鲜 RPMI/10% FCS 培养基至每滴。随后，更换 10 µ每隔一天更换一次培养基。此步骤中使用电子移液器非常有助于操作。
4. 根据细胞类型，在培养10-15天后收获球状体。用PBS小心地将球状体从悬滴细胞培养皿的盖子上冲洗下来。在无菌非黏附性细胞培养皿中收集10-20个球状体。用巴斯德吸管小心吸除多余的PBS。
   注意： 培养周期取决于黑色素瘤细胞最初分离时所处的肿瘤生长阶段， 例如，源自451-LU细胞的球体生长至约500 µ在悬滴培养12天内形成直径约m的细胞团。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清白蛋白（FCS）	Thermo Fisher Scientific	10270106	按10%添加至细胞培养基
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	用PBS稀释至1倍浓度
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	用于黑色素瘤细胞系的培养