Generation of Organotypic Full Skin Reconstructs: A Procedure to Establish 3D Skin Model Using Human Skin Samples

doi:10.3791/20351

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Research Article

器官型全皮肤重建的生成:使用人类皮肤样本建立 3D 皮肤模型的程序

April 30, 2023

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Abstract Protocol Representative Results Disclosures Materials Reprints and Permissions

Abstract

来源:Müller， I. et al. 3D 器官型黑色素瘤球状皮肤模型。J. Vis. Exp. （2018 年）

该视频描述了生成体外 3D 器官型皮肤重建以研究黑色素瘤进展的详细方案。这种皮肤模型模拟了体内器官的结构和多细胞复杂性。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 从表皮中分离原代角质形成细胞

用 PBS 洗涤表皮组织。将表皮切成小块（1 mm²）并将它们收集在 50 mL 锥形管中。加入 10 mL 1x 胰蛋白酶-EDTA（预热至 37 °C），并在 37 °C 的水浴中孵育 5 分钟。每 2 分钟涡旋组织悬液。
通过添加 1 mL 胎牛血清（FCS）终止酶促反应。用 10 mL 塑料移液管上下吹打 4 分钟，重悬细胞。尽量避免气泡和泡沫的形成。
将细胞悬液移液到细胞过滤器（孔径 100 μm）中，置于新鲜的 50 mL 锥形管上，然后用 5 mL PBS 冲洗 3 次。将细胞以 200 x g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于含有 1% （v/v）庆大霉素的 2-6 mL 培养基中。通过在血细胞计数器中计数细胞来手动确定细胞数量，并将 6 x 10⁵ 个细胞接种到 T75 细胞培养瓶中。

2. 从真皮中分离原代成纤维细胞

将真皮组织切成更小的块（1 mm²）并将它们转移到 50 mL 锥形管中。加入 10 mL 胶原酶溶液（PBS⁺ 溶液中 5 U/mL），并在 37 °C 的水浴中孵育 45 分钟。将组织块和细胞的混合物以 200 x g 离心 5 分钟。
用 10 mL DMEM 洗涤细胞沉淀两次，其中含有 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，但不含 L-丙酮酸。最后，将组织块重悬于含有 1% （v/v）庆大霉素和 10% FCS 的 2 mL DMEM 中。将它们转移到 T25 细胞培养瓶中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育过夜><。注:小体积允许成纤维细胞从组织碎片中迁移出来，并迫使它们附着在培养瓶上。
第二天早上，再加入 6 mL DMEM/庆大霉素/FCS，并在 37 °C 下孵育 2-3 天，直到细胞达到 80-90% 汇合。

3. 器官型全皮肤重建的真皮隔室的产生

使用放置在 24 孔板中的 24 孔细胞微孔膜插入物（孔径 8 μm）生成皮肤模型><。 注意:确保不要使用悬挂但直立的插件，因为它们将被放入 6 孔板中，以便在后期进行气液培养。
制备凝胶中和溶液（GNL）以及称为 MM 和内皮生长培养基（EGM）的培养基。为防止凝固，将 I 型胶原蛋白（通常来自大鼠尾巴，3.5-4 mg/mL 在 0.02 N 乙酸中）储存在冰上直至使用，因为它在 RT 下开始凝胶化。
GNL 中重悬每个插入片段 1 x 10⁵ 个成纤维细胞，并以 1:3 的比例将细胞悬液与胶原蛋白快速混合，最终体积为 500 μL/插入片段。通过轻轻上下移液来混合，以避免气泡形成，因为气泡可能会损害皮肤重建的质量。
通过在无菌罩中在没有培养基的情况下在 RT 下放置 30 分钟，让单个皮肤凝胶沉淀。随后，用含有 4.5 g/L 葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、10% FCS 且不含 L-丙酮酸的 DMEM 覆盖每个凝胶，并在 37 °C 下孵育过夜。

4. 器官型全皮肤重建的表皮隔室的产生

第二天，从真皮凝胶中取出培养基，并用 EGM 培养基（10% FCS、1% PenStrep、10 mg/mL 庆大霉素）在 37 °C 下平衡 2 小时。取出培养基并小心接种 1 x 10⁵ 个角质形成细胞，这些细胞重悬于真皮凝胶顶部的 100 μL EGM 中。
将重建体在 37 °C 下孵育 1.5 小时，以使角质形成细胞粘附在真皮隔室><上。 注意:在此孵育时间内，由于成纤维细胞诱导的收缩，凝胶将开始收缩，因此，至少部分从插入壁上分离。
用大约 800 μL EGM 覆盖皮肤当量，并用小（白色）移液器吸头小心地从插入壁上去除残留的凝胶。将皮肤等价物浸没在 EGM 中，在 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养箱中培养 7 天，并每隔一天更换一次培养基><。 注意: 在此期间，皮肤等效物将显著收缩。

5. 器官型全皮肤重建的气液培养

第 8 天，将每个插入物转移到 6 孔板的单个孔中。仅向每个孔中加入 1.2-1.4 mL 的 MM 培养基，以便从孔底部为皮肤重建提供培养基，但不被培养基覆盖><。 注意: 在气液界面进行培养允许表皮部分分层并建立完整的角质层（角质层）。
在接下来的 10-17 天内，请每隔一天按照第 5.1 节所述更换介质。在此期间，根据需要向培养基中添加药物或其他刺激物。使用弯曲的镊子小心地从微孔膜插入物中取出完整的皮肤重建物，以进行进一步分析，例如免疫组织化学分析（图 1）。

Representative Results

图 1
图 1:3D 器官型皮肤的培养在培养基中和气液界面处重建。在第 0 天，原代角质形成细胞接种在真皮区室的顶部，该室由嵌入 I 型胶原基质中的原代成纤维细胞组成。3D 皮肤重建在用 EGM 浸没培养 7 天，从插入壁上分离，并开始收缩。在第 8 天，将插入片段转移到 6 孔中并在气液界面培养以允许表皮分层。

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 胎儿血清白蛋白（FCS）赛默飞世尔科技 10270106 向细胞培养基中加入 10 % 胰蛋白酶-EDTA 赛默飞世尔科技 25300054 在 PBS 中稀释 1X DMEM 系列赛默飞世尔科技 41965062 用于原代成纤维细胞的培养分散 Gibco Life 技术 17105041 2U/ml，溶于 PBS 中 I 型胶原蛋白 BD生物科学公司 354249 通常来自大鼠尾巴，浓度应为 3.5-4 mg/ml 24 孔小室 Nunclon Nunc 系列 140629 孔径为 8 μm;使用直立插件，而不是悬挂插件细胞过滤器 BD 猎鹰 352360 黄色庆大霉素赛默飞世尔科技 15750060 溶于 PBS Keralife keratincyte 培养基单元系统不要添加 FCS 或抗生素胶原酶塞尔瓦编号 17454 NB4 标准级幼年人角质形成细胞单元系统 FC-0007 替代自有的幼年包皮制剂幼年人成纤维细胞单元系统 FC-0001 替代自有的幼年包皮制剂 EGF Gibco Life 技术编号 13247-051 仅添加 10 ng/ml 用于生成 EGM 培养基氯化钙默克化学 2381 元添加 1.9 mM 用于生成 EGM，添加 3.8 mM 用于 MM 培养基硒酸阿尔法埃撒编号 18851 添加 53 nM 以生成 EGM 和 MM 培养基胰岛素莉莉 HI0219 嗡嗡声笔 3ml 100 EI/ml 添加 5 μg/ml 用于生成 EGM 和 MM 培养基乙醇胺西格玛-奥德里奇编号 E-0135 添加 0.1 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基对乙醇胺西格玛-奥德里奇编号 P-0503 添加 0.1 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基全转铁蛋白西格玛-奥德里奇编号 T-0665 添加 5 μg/ml 用于生成 EGM 和 MM 培养基三碘甲腺原氨酸西格玛-奥德里奇 T-6397 添加 20 pM 以生成 EGM 和 MM 培养基氢化可的松西格玛-奥德里奇编号: H-088816 添加 0.4 μg/ml 用于生成 EGM 和 MM 培养基孕酮西格玛-奥德里奇货号 P-8783 仅添加 10 nM 用于生成 EGM 培养基赫普斯西格玛-奥德里奇 H-3784 型添加 15 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基丝氨酸西格玛-奥德里奇 S-4311型添加 1 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基氯化胆碱西格玛-奥德里奇编号 C-7017 添加 0.64 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基 dFCS 西格玛-奥德里奇 F-0392 拍品 086K0361 添加 2 % 用于生成 EGM 和 MM 培养基腺嘌呤西格玛-奥德里奇编号: A-9795 添加 0.18 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基 L-谷氨酰胺 PromoCell （促销细胞）编号: C-42209 添加 7.25 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基氯化锶西格玛-奥德里奇 255521 添加 1 mM 以生成 EGM 和 MM 培养基

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