类器官全层皮肤重建的生成：利用人皮肤样本建立三维皮肤模型的操作流程

摘要

来源：Müller, I. 等。 一种三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型。J. Vis. Exp. (2018)

本视频详细介绍了生成 体外 用于研究黑色素瘤进展的三维类器官皮肤重建模型。该皮肤模型可模拟器官的结构及多细胞复杂性 体内.

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 从表皮分离原代角质形成细胞

1. 用 PBS 清洗表皮组织。将表皮切成较小的片段（1 mm²），收集至 50 mL 圆锥形离心管中。加入 10 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液（预热至 37 °C），在 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。每隔 2 分钟涡旋振荡一次组织悬液。
2. 加入 1 mL 胎牛血清（FCS）以终止酶反应。用 10 mL 塑料移液管反复吹打 4 分钟，使细胞重悬。尽量避免产生气泡和泡沫。
3. 将细胞悬液通过置于新 50 mL 圆锥形离心管上方的细胞筛（孔径 100 µm）过滤，并用 5 mL PBS 洗涤 3 次。在 200 ×g 条件下离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 2–6 mL 含 1%（v/v）庆大霉素的培养基中。使用血细胞计数板人工计数细胞，并将 6 × 10⁵ 个细胞接种至 T75 细胞培养瓶中。

2. 从真皮中分离原代成纤维细胞

1. 将真皮组织切成更小的组织块（1 mm²），转移至50 mL锥形管中。加入10 mL胶原酶溶液（5 U/mL，溶于PBS⁺），在37 °C水浴中孵育45分钟。将组织块与细胞混合物在200 ×g条件下离心5分钟。
2. 用10 mL含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺但不含L-丙酮酸的DMEM洗涤细胞沉淀两次。最后，将组织块重悬于2 mL含1%（v/v）庆大霉素和10%胎牛血清（FCS）的DMEM中。转移至T25细胞培养瓶中，在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中过夜孵育。
   注意：较小的体积有助于成纤维细胞从组织碎片中迁移出来，并促使其贴附于培养瓶壁。
3. 次日早晨，再加入6 mL DMEM/庆大霉素/FCS培养基，在37 °C继续孵育2–3天，直至细胞达到80–90%融合度。

3. 类器官全层皮肤重建中真皮层的构建

1. 使用置于24孔板中的24孔细胞微孔膜插件（孔径8 µm）制备皮肤模型。
   注意：请确保使用直立式插件而非悬挂式插件，因为后续阶段需将其转移至6孔板中进行气液界面培养。
2. 配制凝胶中和溶液（GNL）以及分别称为MM和内皮细胞生长培养基（EGM）的培养液。为防止凝固，胶原蛋白I型（通常来源于大鼠尾部，浓度为3.5–4 mg/mL，溶于0.02 N乙酸）需冰上保存至使用前，因其在室温下会开始凝胶化。
3. 将每插件1 × 10⁵个成纤维细胞重悬于GNL中，并迅速按1:3的比例将细胞悬液与胶原蛋白混合，每插件终体积为500 µL。通过轻柔吹打混匀，避免产生气泡，因气泡可能影响皮肤重建的质量。
4. 将各真皮凝胶置于室温无培养基条件下，在无菌操作台中静置30分钟使其沉降。随后，每孔加入含4.5 g/L葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、10%胎牛血清且不含L-丙酮酸的DMEM覆盖凝胶，并于37 °C孵育过夜。

4. 类器官全皮肤重建中表皮组分的生成

1. 次日，移除真皮凝胶中的培养基，并用EGM培养基（10% FCS、1% PenStrep、10 mg/mL庆大霉素）在37 °C下平衡2小时。吸去培养基后，将重悬于100 µL EGM培养基中的1 × 10⁵个角质形成细胞小心接种至真皮凝胶表面。
2. 将重建皮肤在37 °C下孵育1.5小时，使角质形成细胞黏附至真皮层。
   注意：在此孵育期间，由于成纤维细胞诱导的收缩作用，凝胶将开始收缩，从而至少部分脱离插入物的壁面。
3. 用约800 µL EGM培养基覆盖皮肤等效物，并用小型（白色）移液器吸头小心去除插入物壁上残留的凝胶。将皮肤等效物浸没于EGM培养基中，在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中培养7天，每隔一天更换一次培养基。
   注意：在此期间，皮肤等效物将发生显著收缩。

5. 类全层皮肤重建组织的气液界面培养

1. 第8天，将每个插入物转移至6孔板的单独孔中。每孔仅加入1.2–1.4 mL MM培养基，使皮肤重建组织从孔底部获得培养基供应，但不被培养基浸没。
   注意：气液界面培养可促进表皮部分的分层，并形成完整的角质层（stratum corneum）。
2. 在接下来的10–17天内，按照第5.1节所述每隔一天更换一次培养基。在此期间，可根据需要向培养基中添加药物或其他刺激物。使用弯头镊子小心地将全层皮肤重建组织从微孔膜插入物上取下，用于进一步分析，例如，免疫组织化学分析（图1）。

结果

图1：三维类器官皮肤重建物在完全浸没培养和气液界面培养条件下的培养情况。 在第0天，将原代角质形成细胞接种于真皮隔室顶部，该真皮隔室由嵌入I型胶原基质中的原代成纤维细胞构成。三维皮肤重建物在EGM培养基中完全浸没培养7天后，会从插入物壁上脱离并开始收缩。在第8天，将插入物转移至6孔板中，并在气液界面条件下继续培养，以促进表皮的多层分化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清白蛋白（FCS）	Thermo Fisher Scientific	10270106	向细胞培养基中添加 10%
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	用 PBS 稀释至 1X
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	用于原代成纤维细胞的培养
分散酶（Dispase）	Gibco life technologies	17105041	2U/ml，溶于 PBS
I 型胶原蛋白	BD Biosciences	354249	通常来源于大鼠尾部，浓度应为 3.5–4 mg/ml
24 孔 Nunclon 插件	Nunc	140629	8 µm 孔径；使用直立式插件，而非悬挂式插件
细胞筛	BD Falcon	352360	黄色
庆大霉素（Gentamycine）	Thermo Fisher Scientific	15750060	溶于 PBS
Keralife 角质形成细胞培养基	Cell Systems		不要添加 FCS 或抗生素
胶原酶（Collagenase）	SERVA	17454	NB4 标准级
青少年来源人角质形成细胞	Cell Systems	FC-0007	可替代自青少年包皮制备的细胞
青少年来源人成纤维细胞	Cell Systems	FC-0001	可替代自青少年包皮制备的细胞
EGF	Gibco life technologies	13247-051	仅在制备 EGM 培养基时添加 10 ng/ml
氯化钙	Merck Chemicals	2381	制备 EGM 培养基时添加 1.9 mM，制备 MM 培养基时添加 3.8 mM
亚硒酸	Alfa Aesar	18851	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 53 nM
胰岛素	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 5 µg/ml
乙醇胺	Sigma-Aldrich	E-0135	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.1 mM
磷酸乙醇胺	Sigma-Aldrich	P-0503	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.1 mM
全转铁蛋白（Holo-Transferrine）	Sigma-Aldrich	T-0665	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 5 µg/ml
三碘甲腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T-6397	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 20 pM
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H-088816	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.4 µg/ml
孕酮	Sigma-Aldrich	P-8783	仅在制备 EGM 培养基时添加 10 nM
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 15 mM
丝氨酸	Sigma-Aldrich	S-4311	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 1 mM
氯化胆碱	Sigma-Aldrich	C-7017	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.64 mM
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lot 086K0361	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 2%
腺嘌呤	Sigma-Aldrich	A-9795	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.18 mM
L-谷氨酰胺	PromoCell	C-42209	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 7.25 mM
氯化锶	Sigma-Aldrich	255521	制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 1 mM