来源：Müller, I. 等。 一种三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型。J. Vis. Exp. (2018)
本视频详细介绍了生成 体外 用于研究黑色素瘤进展的三维类器官皮肤重建模型。该皮肤模型可模拟器官的结构及多细胞复杂性 体内.
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方法文章
类器官全层皮肤重建的生成：利用人皮肤样本建立三维皮肤模型的操作流程
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. 从表皮分离原代角质形成细胞
- 用 PBS 清洗表皮组织。将表皮切成较小的片段（1 mm2），收集至 50 mL 圆锥形离心管中。加入 10 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液（预热至 37 °C），在 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。每隔 2 分钟涡旋振荡一次组织悬液。
- 加入 1 mL 胎牛血清（FCS）以终止酶反应。用 10 mL 塑料移液管反复吹打 4 分钟，使细胞重悬。尽量避免产生气泡和泡沫。
- 将细胞悬液通过置于新 50 mL 圆锥形离心管上方的细胞筛（孔径 100 µm）过滤，并用 5 mL PBS 洗涤 3 次。在 200 ×g 条件下离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 2–6 mL 含 1%（v/v）庆大霉素的培养基中。使用血细胞计数板人工计数细胞，并将 6 × 105 个细胞接种至 T75 细胞培养瓶中。
2. 从真皮中分离原代成纤维细胞
- 将真皮组织切成更小的组织块（1 mm2），转移至50 mL锥形管中。加入10 mL胶原酶溶液（5 U/mL，溶于P....
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结果
图1：三维类器官皮肤重建物在完全浸没培养和气液界面培养条件下的培养情况。 在第0天，将原代角质形成细胞接种于真皮隔室顶部，该真皮隔室由嵌入I型胶原基质中的原代成纤维细胞构成。三维皮肤重建物在EGM培养基中完全浸没培养7天后，会从插入物壁上脱离并开始收缩。在第8天，将插入物转移至6孔板中，并在气液界面条件下继续培养，以促进表皮的多层分化。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清白蛋白（FCS） | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | 向细胞培养基中添加 10% |
| 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 用 PBS 稀释至 1X |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | 用于原代成纤维细胞的培养 |
| 分散酶（Dispase） | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml，溶于 PBS |
| I 型胶原蛋白 | BD Biosciences | 354249 | 通常来源于大鼠尾部，浓度应为 3.5–4 mg/ml |
| 24 孔 Nunclon 插件 | Nunc | 140629 | 8 µm 孔径；使用直立式插件，而非悬挂式插件 |
| 细胞筛 | BD Falcon | 352360 | 黄色 |
| 庆大霉素（Gentamycine） | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | 溶于 PBS |
| Keralife 角质形成细胞培养基 | Cell Systems | 不要添加 FCS 或抗生素 | |
| 胶原酶（Collagenase） | SERVA | 17454 | NB4 标准级 |
| 青少年来源人角质形成细胞 | Cell Systems | FC-0007 | 可替代自青少年包皮制备的细胞 |
| 青少年来源人成纤维细胞 | Cell Systems | FC-0001 | 可替代自青少年包皮制备的细胞 |
| EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | 仅在制备 EGM 培养基时添加 10 ng/ml |
| 氯化钙 | Merck Chemicals | 2381 | 制备 EGM 培养基时添加 1.9 mM，制备 MM 培养基时添加 3.8 mM |
| 亚硒酸 | Alfa Aesar | 18851 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 53 nM |
| 胰岛素 | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 5 µg/ml |
| 乙醇胺 | Sigma-Aldrich | E-0135 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.1 mM |
| 磷酸乙醇胺 | Sigma-Aldrich | P-0503 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.1 mM |
| 全转铁蛋白（Holo-Transferrine） | Sigma-Aldrich | T-0665 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 5 µg/ml |
| 三碘甲腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T-6397 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 20 pM |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H-088816 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.4 µg/ml |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P-8783 | 仅在制备 EGM 培养基时添加 10 nM |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 15 mM |
| 丝氨酸 | Sigma-Aldrich | S-4311 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 1 mM |
| 氯化胆碱 | Sigma-Aldrich | C-7017 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.64 mM |
| dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 2% |
| 腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | A-9795 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 0.18 mM |
| L-谷氨酰胺 | PromoCell | C-42209 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 7.25 mM |
| 氯化锶 | Sigma-Aldrich | 255521 | 制备 EGM 和 MM 培养基时均添加 1 mM |
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