$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。
1. B16-BL6 细胞的制备
- 从37摄氏度培养箱中取出细胞培养板，放入无菌操作台。培养板中的B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞应达到约70%的融合度。过高的融合度可能改变细胞的转移潜能。
- 每块培养板加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，静置1分钟，然后吸除胰蛋白酶-培养基混合液。
- 每块培养板再加入1 mL胰蛋白酶溶液，并将培养板放回培养箱中孵育10分钟。
- 将培养板从培养箱转移至无菌操作台后，向每块培养板中加入4 mL无血清的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基。
- 使用无菌电动移液器收集细胞。将移液器吸头以轻微倾斜的角度紧贴培养板底部反复吹打，使细胞充分解离。重复数次以确保细胞团块充分分散，避免后续堵塞注射针头。重新收集细胞悬液并转移至50 mL锥形管中。
- 使用血细胞计数板测定细胞密度。在保持B16-BL6细胞总数不变的前提下，计算所需无血清RPMI培养基的体积，以配制终浓度分别为0、0.065、0.015、0.25和0.5×10⁶个细胞/mL的细胞悬液。
- 将50 mL锥形管中的细胞悬液等量分装至15 mL锥形管中。在2,250 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液。加入适量无血清RPMI培养基，通过血细胞计数板确认目标细胞密度。如需调整密度，可通过添加额外RPMI培养基或再次离心后重悬于较小体积中进行调节。
- 将每种细胞悬液各500 µL分装至预先标记并置于冰上的1.8 mL离心管中。
2. 尾静脉注射
- 购买6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，每组5只。让小鼠适应数天。
- 抓住小鼠尾巴，将其尾部朝向小鼠固定器内引导。当躯干进入固定器主腔而尾巴位于外侧时，将小鼠拉向固定器末端。插入固定器推杆，继续推进直至小鼠被牢固固定。
- 将小鼠旋转 90度，使一侧尾静脉朝上。使用酒精棉片用力擦拭小鼠尾巴侧面，尤其是尾静脉最清晰可见的区域。
注意：良好的照明对于在B57BL/6J小鼠上有效观察尾静脉至关重要。加热灯或加热手术垫虽非必需，但可通过扩张尾静脉体积来辅助操作。
- 在无菌培养罩内，从浓度为2×10⁶个细胞/mL的试管中吸取300 µL细胞培养基。翻转针头，轻弹针管侧面并推动活塞，以排出注射器内的气泡。排出部分培养-RPMI，使最终体积为250 µL。
- 用非惯用手拉直小鼠尾巴。用非惯用手的食指托起尾巴近端，拇指压住远端，使尾巴保持伸展状态。
注意：这样可使尾静脉处于侧向位置，与固定器表面平行，便于在尾巴更远端的位置进行一致性的穿刺进针。
- 将针头以微小的向下角度刺入尾静脉，起始时朝向远端，随后在进一步插入过程中调整针头方向，使其与尾静脉走向一致（相对于针头降低注射器活塞端）。
- 将针头插入尾静脉约1 cm。插入后开始推动活塞，同时保持针头稳定。
注意：若针头位于尾静脉内且针尖未受阻，培养基应能顺畅流入静脉。 成功的注射表现为静脉内血液被迅速冲走。若推注时遇到阻力，或注射部位出现气泡，应立即拔出针头，并在尾静脉更近端的位置重新尝试。
- 拔出针头并丢弃。用纱布按压穿刺部位以止血。
- 取出固定器内的推杆，将小鼠放入受体笼中。
- 对所有其他浓度组重复上述操作。
注意：肺部病灶的形成通常需要约2-3周，具体时间因细胞系及目标病灶大小而异。在此期间，应密切监测小鼠是否出现需提前实施安乐死的症状，如过度喘息等。
3. 计数肺部病灶
- 将小鼠放入 CO2 室内，以每分钟 10-30% 室容积的速度通入 100% CO2 ，持续 5 分钟，实施安乐死。随后进行颈椎脱位。
- 将小鼠仰面固定于泡沫板上。使用手术剪沿胸骨做一手术切口。
- 从胸骨切口顶端开始，分别向小鼠双侧肩部做两个附加切口，暴露肋骨 cage。
- 沿胸骨两侧各做一剪切，移除肋骨 cage，暴露肺和心脏。
- 用手术镊夹住心脏，剪断食管和气管，将心脏和肺从小鼠体内取出。置于解剖显微镜下，放大 10 倍，以便更清晰观察。
- 将心脏从肺组织中分离，并移除胸腺，仅保留两片肺组织。
- 在解剖显微镜下观察肺组织，开始计数肺部病灶。每个病灶应表现为肺表面圆形、棕色的突起。
- 为保证小鼠间计数的一致性，先计数肺叶表面的病灶数量，然后翻转该肺叶。依次单独处理四个肺叶，有助于更准确计数。
- 若需进行免疫组化（IHC），则保存并固定肺组织；否则，丢弃剩余组织。