HCR-DNA FISH：一种用于检测感染细胞中病毒DNA的荧光原位杂交技术

摘要

来源：Wei Liu 等， Merkel细胞多瘤病毒感染与检测，J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，感染了MCPyV病毒颗粒的细胞接受了处理 在 原位 杂交链式反应检测MCPyV特异性基因组。此外，将DNA-HCR技术与FISH相结合，以可视化感染的人皮肤细胞中的MCPyV DNA。

方案

1. 感染

1. 在含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养原代人皮肤成纤维细胞。当细胞达到汇合时，以1:4比例传代，无需离心。
   注意： 为获得最高的MCPyV感染效率，应使用传代5至12代之间、在接种时处于活跃分裂状态的原代成纤维细胞。
2. 感染人皮肤成纤维细胞时，吸除培养基，并用DPBS洗涤细胞。
3. 向培养皿中加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5–10分钟。
4. 在显微镜下观察，确保细胞已从培养皿上脱落。
5. 加入10 mL DMEM/F12培养基（含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和3 µM CHIR99021，均可促进MCPyV感染）至培养皿中，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
6. 以 180 x g 离心细胞 g 2分钟，弃去上清液。将细胞重悬于含有20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和3 µM CHIR99021的DMEM/F12培养基中，细胞密度为2-4 × 10⁴ 每毫升细胞数
7. 将含有1 mg/mL IV型胶原酶的细胞悬液200 µL接种至96孔板的每个孔中。将MCPyV病毒颗粒储备液置于冰上解冻。加入10⁹ 每感染 2,500 至 5,000 个细胞，向每 1 µL 碘克沙醇中加入相应量的 MCPyV 病毒颗粒病毒基因组当量。轻轻敲击培养板侧壁，将培养板放入培养箱中。
8. 37 °C、5% CO₂条件下孵育后₂ 孵育48–72小时后，向每孔加入20%胎牛血清（FBS）。
9. 在37 °C、5% CO₂条件下继续进行感染₂ 72–96 小时。

2. 原位 DNA-HCR

1. 用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定盖玻片上的培养细胞，固定 10 分钟。用 PBS 洗涤盖玻片两次，然后在 4 °C 下用 70% 乙醇处理过夜，以通透细胞。
   注意： 固定后的样品可在此状态下保存数天。
2. 用探针杂交缓冲液替换乙醇，室温孵育 60 分钟，进行预杂交。
3. 在预杂交步骤结束前 30 分钟，将探针（1 µM）（表 1）按 1:500 比例稀释于探针杂交缓冲液中，并在 45 °C 下孵育。
4. 孵育结束后，将约 10 μL 稀释后的探针混合液滴加至载玻片上（每张盖玻片对应一滴）。将盖玻片细胞面向下放置于各自的探针杂交液滴上。用足量橡胶胶水将盖玻片边缘及背面密封固定于载玻片上。
5. 将加有探针的载玻片置于平放的加热块上，在 94 °C 加热 3 分钟。随后将载玻片转移至湿化室中，在 45 °C 下过夜孵育。制备简易湿化室的方法：将无菌纸巾用 dH₂O 轻轻润湿后置于带有橡胶垫圈密封盖的塑料容器底部。
   注意： 加热过程中橡胶胶水可能会短暂起泡，但需确保密封未被破坏。
6. 用镊子小心剥离橡胶胶水，将盖玻片细胞面向上重新放回 24 孔板的孔中。用探针洗涤缓冲液在室温下洗涤盖玻片三次。
7. 将盖玻片在扩增缓冲液（24 孔板中每孔 200 µL）中室温孵育 30–60 分钟。
8. 同时，在避光条件下，分别将两种识别探针的标记寡核苷酸发夹结构（表 1）在独立的 PCR 管中进行退火处理：94 °C 加热 90 秒，随后冷却至室温并保持 30 分钟。将两种发夹结构按各 1:50 的比例混合于扩增缓冲液中。
9. 将 24 孔板盖的开口面覆盖上石蜡膜，形成扩增反应表面。为每张盖玻片在石蜡膜上滴加 50–100 µL 发夹结构/扩增缓冲液混合液。用镊子小心从预扩增溶液中取出盖玻片，用多孔一次性擦拭纸轻触边缘以吸干液体，然后细胞面向下放置于扩增液滴上。
10. 将承载盖玻片的板盖放入湿化室中，于室温避光条件下过夜孵育。
11. 再次将盖玻片放回 24 孔板的孔中。加入含 0.5 µg/mL DAPI 的 5x SSCT [5x 氯化钠-柠檬酸钠（SSC）缓冲液含 0.1% Tween 20，经 0.22 µm 滤膜过滤]，室温孵育 1 小时。随后在室温下用 5x SSCT 洗涤两次。
12. 将盖玻片封片于显微镜载玻片上。使用倒置荧光显微镜观察细胞并对样品成像。

MCPyV 探针 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 探针 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
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MCPyV 探针 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
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MCPyV 探针 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 探针 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV 探针 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
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HPV 探针 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
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表1：本研究中使用的探针。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
探针杂交缓冲液	分子技术
探针洗涤缓冲液	分子技术
扩增缓冲液	分子技术
Alexa 594标记的发夹探针	分子技术	B4	避光保存
多聚甲醛	Sigma	P6148