人皮肤角质形成细胞的分离：一种从皮肤样本中培养原代角质形成细胞的方法

摘要

Johansen, C. 等 成人皮肤来源的人类原代角质形成细胞的制备与培养. J. Vis. Exp. (2017)

本视频介绍了通过酶消化与机械破碎相结合的方法，分离人类皮肤表皮层中最主要的细胞——角质形成细胞。该方法利用选择性培养基，促进角质形成细胞相对于其他皮肤细胞类型的优先生长。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 从人皮肤中分离角质形成细胞

1. 首先配制以下溶液：50 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 0.1% 葡萄糖的 DPBS 溶液。混合后用 0.2 µm 滤器过滤除菌。准备 10 mL RPMI-1640 + 2% FBS 溶液、50 mL DPBS 以及无血清角质形成细胞培养基（KSFM）。向 500 mL KSFM 中加入 KSFM 添加剂和 250 µL 庆大霉素。使用前将所有溶液预热至 37 °C。
2. 收集接受整形手术的健康成年志愿者的皮肤组织。所用皮肤样本大小约为 10 cm × 15 cm，但可有所变化。运输过程中将皮肤样本置于含有冷却元件的泡沫箱中以保持低温。如有必要，皮肤样本可在 4 °C 下保存过夜。
3. 使用无菌剪刀、手术刀和镊子去除皮肤组织下方的脂肪。
4. 用针头将皮肤组织（约 10 cm × 15 cm）固定在培养皿上方的无菌盖上。首先用干燥的无菌纱布擦拭皮肤表面，然后用浸有 70% 乙醇的无菌纱布再次清洁皮肤。
5. 使用足部刨刀切除皮肤组织的上层（表皮），并将表皮放入一个 9 cm 的培养皿中。立即向培养皿中加入 25 mL 第 1.1 步配制的 DPBS/胰蛋白酶/葡萄糖溶液。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	细胞培养基
KSFM 添加剂	ThermoFisher Scientific	37000-015	KSFM 培养基专用添加剂
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	不含钙和 镁的 DPBS
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	二甲基亚砜
庆大霉素	ThermoFisher Scientific	15710-049	细胞培养基添加剂
灭菌滤器	Sartorius	16534	孔径为 0.2 µm 的注射器滤器
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T7409	用于细胞消化
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	用于中和胰蛋白酶活性
镊子	-	-	任何公司的镊子均可 使用
剪刀	-	-	任何公司的剪刀均可 使用
手术刀	Swann Morton	0501	任何公司的手术刀均可 使用
70% 乙醇	-	-	-
纱布垫	NOBAMED	875420	任何供应商的纱布垫均可 使用
足部削皮器	Credo Solingen	1510	任何供应商的足部削皮器均可 使用
培养皿	TPP	93100	任何供应商的培养皿均可 使用
金属滤网	-	-	自制金属滤网，孔径 1 mm
75 cm2 培养瓶	NUNC	156499	-
150 cm2 培养瓶	TTP	90151	-
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	ThermoFisher Scientific	25300-062	传代时用于细胞消化