黑色素瘤干细胞分离:一种使用磁激活细胞分选获得 CD133 阳性和阴性黑色素瘤细胞的方法

1. 使用 LS 柱对 CD133 ⁺ 和 CD133^- 黑色素瘤细胞进行磁性细胞分选

1. 在 PBS 中制备含有 2 mM EDTA 和 5% FCS 的 MACS 缓冲液。使用 0.22 μm Steritop-GP 过滤装置通过倒置和无菌滤液缓冲液混合。将缓冲液冷却至 4-8 °C，并在使用前脱气。
2. 将 Accutase、PBS 和 Quantum 263 培养基预热至 37 °C。
3. 用 PBS 洗涤 80% 汇合细胞。加入适量的 Accutase 并孵育直至细胞从培养表面分离。使用 Quantum 263 培养基将细胞收集到 50 mL 试管中。
4. 确定细胞数量，并在 300 x g 和 4-8 °C 下离心所需数量的细胞 5 分钟。（根据 Miltenyi 的方案，每个 LS 柱最多可以加载 2x 10⁹ 个细胞。应确定细胞系特异性最佳数量，并且可以相当低。完全吸出上清液。
5. 用 350 μL MACS 缓冲液重悬最多 1x 10^{个 8} 个细胞（对于更高的细胞数量，相应地增加以下所有 MACS 缓冲液、FcR 封闭试剂、CD133/1-生物素和抗生物素 MicroBeads 体积）。
6. 加入 100 μL FcR 封闭试剂。
7. 添加 50 μL CD133/1-生物素。使用涡旋充分混合，并在 4-8 °C 下孵育 10 分钟。
8. 加入 10 mL MACS 缓冲液洗涤细胞，并在 300 x g 和 4-8 °C 下离心 5 分钟。完全吸出上清液。
9. 重复洗涤步骤 （1.8）。
10. 用 400 μL MACS 缓冲液重悬细胞沉淀。
11. 添加 100 μL 抗生物素 MicroBeads。使用涡旋充分混合，并在 4-8 °C 下孵育 15 分钟。
12. 同时，准备用于磁分离的 MACS 分离器。将 QuadroMACS 连接到 MACS 分离器多功能支架。将所需数量的 LS 色谱柱和色谱柱翼插入 QuadroMACS 磁场的前面。将分离前过滤器（带 30 μm 尼龙网）放入每根 LS 色谱柱中，并在每根色谱柱下放置合适的收集管（15 mL 或 50 mL）。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗，准备过滤器和色谱柱。丢弃流出物。
13. 加入 10 mL MACS 缓冲液洗涤细胞，并在 300 x g 和 4-8 °C 下离心 5 分钟。完全吸出上清液。
14. 用 500 μL MACS 缓冲液重悬细胞，并使用预分离过滤器将细胞悬液涂在 LS 柱上。
15. 每根柱子用 3 mL MACS 缓冲液洗涤 3 次。仅在色谱柱储液器为空时添加新鲜缓冲液。
16. 收集的总流出物包含未标记的 CD133 ^细胞组分。
17. 丢弃预分离过滤器，从分离器中取出色谱柱，并将其放在合适的收集管上。
18. 应用 5 mL MACS 缓冲液。将柱塞用力推入柱中，立即冲洗掉标记的 CD133 ⁺ 细胞。
19. 为了提高负馏分的纯度，将细胞悬液涂在插入 QuadroMACS 的新平衡 LS 柱上。流出物含有 CD133^- 组分。
20. 丢弃列。