黑色素瘤干细胞分离：利用磁性激活细胞分选技术获取CD133阳性和阴性黑色素瘤细胞的方法

摘要

来源：Welte, Y. 等. 黑色素瘤患者来源的细胞培养及CD133+肿瘤干细胞样细胞的分离. J. Vis. Exp. (2013)

本视频介绍了利用磁性激活细胞分选技术从原代黑色素瘤细胞系中分离CD133阴性和阳性黑色素瘤干细胞的方法。进一步研究CD133阳性的黑色素瘤肿瘤干细胞，以理解黑色素瘤发生机制。

方案

1. 使用LS柱对CD133⁺ 和CD133^- 黑色素瘤细胞进行磁珠分选

1. 制备含 2 mM EDTA 和 5% FCS 的 PBS MACS 缓冲液。通过倒置混匀，并使用 0.22 μm Steritop-GP 滤器单元进行无菌过滤。将缓冲液冷却至 4–8 °C，并在使用前脱气。
2. 将 Accutase、PBS 和 Quantum 263 培养基预热至 37 °C。
3. 用 PBS 洗涤 80% 汇合度的细胞。加入适量 Accutase，孵育至细胞从培养表面脱落。使用 Quantum 263 培养基将细胞收集至 50 mL 离心管中。
4. 计数细胞，并以 300 ×g 离心 5 分钟，温度为 4–8 °C，收集所需数量的细胞。（根据 Miltenyi 的方案，每根 LS 柱最多可上样 2×10⁹ 个细胞。应根据细胞系确定最佳细胞数量，该数量可能显著更低。）彻底吸除上清液。
5. 将最多 1×10⁸ 个细胞重悬于 350 μL MACS 缓冲液中（若细胞数量更高，需按比例增加后续所有 MACS 缓冲液、FcR 封闭试剂、CD133/1-Biotin 和抗生物素微珠的体积）。
6. 加入 100 μL FcR 封闭试剂。
7. 加入 50 μL CD133/1-Biotin。充分涡旋混匀，并在 4–8 °C 下孵育 10 分钟。
8. 加入 10 mL MACS 缓冲液洗涤细胞，并以 300 × g 离心 5 分钟，温度为 4–8 °C。彻底吸除上清液。
9. 重复步骤 1.8 的洗涤操作。
10. 将细胞沉淀用 400 μL MACS 缓冲液重悬。
11. 加入 100 μL 抗生物素微珠。充分涡旋混匀，并在 4–8 °C 下孵育 15 分钟。
12. 同时，准备用于磁性分离的 MACS 分离器。将 QuadroMACS 连接到 MACS 分离器多联支架上。将所需数量的 LS 柱插入 QuadroMACS 的磁场中，柱翼朝前。在每根 LS 柱中放入一个预分离滤器（含 30 μm 尼龙网），并在每根柱下方放置合适的收集管（15 mL 或 50 mL）。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗滤器和柱子以进行预平衡。弃去流出液。
13. 加入 10 mL MACS 缓冲液洗涤细胞，并以 300 × g 离心 5 分钟，温度为 4–8 °C。彻底吸除上清液。
14. 将细胞用 500 μL MACS 缓冲液重悬，并将细胞悬液通过预分离滤器上样至 LS 柱。
15. 每根柱用 3 mL MACS 缓冲液洗涤三次。仅当柱子储液器排空后才加入新鲜缓冲液。
16. 收集的总流出液含有未标记的 CD133⁻ 细胞组分。
17. 弃去预分离滤器，从分离器上取下柱子，并将其置于合适的收集管上。
18. 加入 5 mL MACS 缓冲液。立即用力将推杆插入柱内，快速洗脱出标记的 CD133⁺ 细胞。
19. 为提高阴性组分的纯度，可将细胞悬液上样至插入 QuadroMACS 的一根新的平衡 LS 柱。流出液即为 CD133⁻ 组分。
20. 弃去柱子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
人源间接 CD133 微珠试剂盒	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	包含：CD133/1(AC133)-生物素、抗生物素微珠及 FcR 阻断试剂
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
MACS 分离器多功能支架	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS 分离柱 25 LS 柱	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976