化学诱导的两阶段皮肤癌变模型：一种体内小鼠皮肤癌实验模型

摘要

来源：Vähätupa, M. 等。 使用二甲基苯并[a]蒽和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（DMBA-TPA）建立化学诱导皮肤癌模型。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了通过外用化学物质诱导两阶段皮肤癌变以研究肿瘤起始过程的实验方法。第一步是在小鼠模型皮肤上涂抹一种致突变剂DMBA，通过引起干细胞突变来启动肿瘤形成；随后使用促生长剂TPA处理，以加速皮肤乳头状瘤的形成。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 实验动物、试剂与仪器

1. 使用年龄和性别匹配的小鼠。在7-9周龄时开始实验，因为大多数小鼠在此年龄段皮肤处于休止期（telogen）。
2. 在实验过程中观察动物行为，若发生争斗（雄性小鼠常出现此情况），应将它们分笼饲养。打斗可能导致皮肤破损，从而促进肿瘤形成。由于雌性小鼠攻击性较弱，通常更优先选用。典型的实验组每组动物数量为8-20只。
   注意：基于前期研究中观察到的生物学变异进行功效计算，有助于选择足够大的样本量。本文示例中使用的小鼠品系包括Balb/c和C57BL/6。然而，其他多种小鼠品系（如SENCAR和FVB）以及Wistar和Sprague-Dawley大鼠也已成功应用于DMBA-TPA模型。在启动实验前，必须获得国家或地方动物实验管理委员会的许可。除一般福利考量外，该模型的特异性终点通常为鳞状细胞癌（SCC）和皮肤感染。使用丙酮溶解致癌化学物后涂抹皮肤引起的搔痒所致抓痕较为常见，除此之外动物不应表现出任何不适迹象。定期称重（例如每月两次）有助于评估动物福利状况。
3. 使用DMBA和TPA，二者均以丙酮稀释。DMBA的工作浓度为250 g/L，每只动物剂量为200 µL丙酮中含有50 µg DMBA。TPA的储备浓度为125 g/L，处理浓度为25 g/L，每只动物剂量为200 µL丙酮中含有5 µg TPA。
   警示：DMBA吞食有害并可能致癌。丙酮易挥发且易燃，可能引起头晕并对眼睛产生刺激。操作时应佩戴呼吸面罩和/或在通风橱内进行。接触上述化学品后应及时更换手套。使用独立通风笼具可防止小鼠饲养期间化学品扩散。施用后，收集用于操作DMBA的移液器吸头，并作为危险废物妥善处置。
   注意：DMBA需避光保存。稀释后的TPA应储存在-20 °C，最好也避光保存。
4. 准备以下设备：天平、普通剃毛器、适当规格的移液器及吸头、普通直尺、数码相机、记录用笔记本和笔或计算机（用于记录乳头状瘤）、吸入式麻醉系统或背部顶端开口的小鼠固定器，以及用于处死小鼠的二氧化碳麻醉系统。

2. 皮肤乳头瘤的诱导与促发

1. 剃除动物背部的皮肤毛发并称重。之后根据需要剃毛，但在化学物质暴露时不要剃毛。
   注意：剃毛时需小心避开乳头状瘤区域，避免在皮肤上造成任何划伤。每两周称量每只动物的体重，以监测可能出现的体重下降。
2. 在剃毛后48小时，使用移液器将50 µg DMBA溶于200 µL丙酮中，局部涂抹于剃毛区域。如有需要，可使用轻度吸入麻醉或小鼠固定器固定动物。
3. 7天后给予首次TPA剂量。将5 µg TPA溶于200 µL丙酮中，使用移液器每周局部涂抹两次，建议安排在周一和周四，或周二和周五。
4. 每周对乳头状瘤进行计数、记录并拍照。凡直径大于1 mm且持续存在超过1周的可触及肿块即视为乳头状瘤。在示意图上标记每个独立的乳头状瘤，并每周记录其大小——同时保存数码照片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7,12-二甲基苯并[a]蒽（DMBA）	Sigma	D3254-100MG	吞咽有害，可能致癌。需避光保存。
丙酮	Sigma	1000141011	易挥发且易燃。
Attane vet 1000 mg/g	Piramal Critical Care Limited		用于吸入的液态异氟烷
电池驱动剃毛器 Isis	Albert Kerlb GmbH	GT421	用于剃除毛发
CONTRAfluran-废气过滤器	ZeoSys GmbH		用于麻醉
Linex Nature N1030 30 cm 尺子	Staples Business Advantage	60383	用于测量乳头状瘤
Tacta 移液器 100-1000 µl	Sartorius	LH-729070
Tacta 移液器 20-200 µl	Sartorius	LH-729060
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（又称12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，TPA）	Enzo	BML-PE160-0001
Mekasoft	Mekalasi	23008	实验台覆盖物
精密天平 PLJ-C/PLJ-G	KERN & SOHN GmbH	PLJ 600-3CM
小鼠（Balb/c JRj）	Janvier labs		其他品系亦可使用
小鼠（C57BL/6JRj）	Janvier labs		其他品系亦可使用
Panasonic Lumix DMC-FS5 数码相机	Panasonic