快速培养原代小鼠黑素细胞和成纤维细胞：从小鼠全皮组织样本中分离黑素细胞和成纤维细胞

摘要

来源：Murphy, B. M. 等. 快速建立原代小鼠黑色素细胞与成纤维细胞培养物. 视觉化实验杂志 (2019)

本视频介绍了一种从新生小鼠皮肤中快速分离并同时培养黑素细胞和成纤维细胞的方法。这些细胞可被长期维持并进行实验操作 体外 用于研究皮肤细胞生物学、伤口愈合及黑色素瘤。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 黑色素细胞和成纤维细胞的分离

1. 通过断头法处死 0 至 4 日龄的雄性 和/或 雌性 C57Bl/6J 幼鼠，并使用手术剪去除已处死小鼠的四肢。
2. 在超净工作台内，将每只小鼠的躯干在含有 70% 乙醇的无菌培养皿中短暂滚动。将躯干从乙醇中取出后，放入另一个无菌的空培养皿中。
3. 使用经 70% 乙醇灭菌的手术剪，在小鼠躯干腹侧皮肤上从颈部至尾部做一纵向切口。用无菌镊子将皮肤从小鼠躯干上剥离。
4. 将剥离的皮肤真皮面朝下，放入含有 3 mL 1× 抗生素/抗真菌溶液的 6 孔板中，室温孵育 2–3 分钟。
5. 开启组织切片机，并设置如下参数：切片厚度：1 µm；刀片力度：约最大值的 60%；速度：约最大值的 50%。
6. 将皮肤真皮面朝下转移至无菌的组织切片机圆盘上，将皮肤完全通过已启动的组织切片机切割 3 次。
7. 将均质化的皮肤转移至一个无菌的 15 mL 锥形离心管中，管内预先加入 3 mL 皮肤消化缓冲液（新鲜配制 3 mL 皮肤消化缓冲液：在 RPMI 1640 培养基中加入 10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素溶液、1% L-谷氨酰胺、10 mg/mL I 型胶原酶、0.25% 猪胰蛋白酶和 0.02 mg/mL 脱氧核糖核酸酶 I）。使用 P1000 移液器上下吹打 10–15 次，混匀所得悬液。
8. 盖紧离心管，将样品置于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟，每 3–5 分钟轻柔颠倒混匀一次。
9. 将离心管在室温下以摆动转子离心，750 × g 离心 5 分钟，使皮肤匀浆中的细胞沉淀。
10. 使用 P1000 移液器缓慢且彻底地移除皮肤消化缓冲液，注意不要扰动沉淀。
    注意：此步骤可保留部分完整皮肤作为对照，用于验证细胞纯度。将这些细胞经 70 μm 细胞滤器过滤后进一步处理。
11. 用 P1000 移液器上下吹打 15–20 次，将细胞沉淀在 1 mL 黑素细胞培养基中充分重悬。将所得细胞悬液逐滴加入一个未包被的 6 孔板孔中，每孔预先加入 1 mL 黑素细胞培养基。
12. 将接种后的皮肤匀浆置于设定为 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中，孵育 40 分钟。
    注意：在此期间，皮肤匀浆中的部分成纤维细胞会贴附于未包被的培养板，而黑素细胞和角质形成细胞则保持悬浮状态。
13. 将未包被孔中的培养上清转移至一个预先清洗并经胶原包被的 6 孔板的一个孔中。向培养基中加入 G418，使终浓度为 100 ng/mL。
14. 向含有已贴壁成纤维细胞的未包被孔中加入 2 mL 成纤维细胞培养基。
15. 将两种培养物均在设定为 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中过夜孵育。
16. 接种后 16–24 小时，分别吸除各培养物中的培养基及碎片。每孔用 1 mL 无菌 PBS 洗涤两次，然后向黑素细胞培养物中加入含 100 ng/mL G418 的新鲜黑素细胞培养基 2 mL，向成纤维细胞培养物中加入新鲜成纤维细胞培养基 2 mL。（新鲜配制 6 mL 黑素细胞培养基：在 Nutrient Mix F-12 Ham's 培养基中加入 10% 胎牛血清、7% 马血清、1% 青霉素/链霉素溶液、1% L-谷氨酰胺、0.5 mM 二丁酰环磷酸腺苷（dbcAMP）、20 nM 十四酰基佛波醇乙酸酯（TPA）和 200 pM 霍乱毒素（CT）。
    注意： dbcAMP、TPA 和 CT 的浓缩母液可分装并保存于 -80 °C，保存时间超过 >1 年。不含这些成分的基础培养基可在 4 °C 保存最多 1 个月。
    配制 4 mL 成纤维细胞培养基：在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中加入 10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺。该培养基可在 4 °C 保存最多 1 个月）
17. 黑素细胞培养物经 G418 处理 48 小时后，用 1 mL 无菌 PBS 洗涤细胞两次，并向培养物中加入不含 G418 的新鲜黑素细胞培养基 2 mL。
    注意：在 G418 处理后，黑素细胞培养物中的成纤维细胞会持续死亡，应使用无菌 PBS 洗涤培养皿以去除死细胞，并更换新鲜黑素细胞培养基。当黑素细胞和成纤维细胞培养物达到 70–80% 汇合度时，应进行传代。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇，200 proof	Fisher Scientific	22032601
抗生素-抗真菌溶液（100倍浓缩）	Sigma-Aldrich	A5955
McIlwain 组织切碎机	Ted Pella	10180
组织切碎机刀片	Ted Pella	121-6
组织切碎机塑料圆盘	Ted Pella	10180-01
I型胶原酶	Worthington Biochemicals	LS004156
猪胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	85450C
胰蛋白酶	VWR	VWRL0154-0100
G418 二硫化物	P212121	LGB-418-1
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	12800-082
RPMI 1640 培养基	Sigma-Aldrich	R8758
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537
6 孔细胞培养皿	Sigma-Aldrich	SIAL0516
5 mL 聚苯乙烯圆底试管	Fisher Scientific	352008
10 cm 细胞培养皿	Corning	430167
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP9706-100
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12306C
Corning 青霉素/链霉素溶液	Fisher Scientific	30-002-CL
Ham's F-12 营养混合物	Sigma-Aldrich	N6760
大鼠尾胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C7661
0.2 µm PES 无菌注射器滤器	VWR	28145-501
40 µm 细胞筛	Fisher Scientific	22363547
70 µm 细胞筛	Fisher Scientific	22363548
霍乱毒素	Sigma-Aldrich	C8052
马血清	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	SH3003402