重组 Merkel 细胞多瘤病毒 (MCPyV) 病毒颗粒制备：一种高效制备高滴度重组 MCPyV 病毒颗粒的技术

摘要

来源：Wei Liu 等。 Merkel细胞多瘤病毒感染与检测，J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们展示了使用273TT细胞制备默克尔细胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus，MCPyV）病毒颗粒的方法。该技术有助于产生高滴度的重组MCPyV病毒颗粒。

方案

1. 重组MCPyV病毒颗粒的制备

1. 在200 µL反应体系中，用250 U BamHI-HF酶切50 µg pR17b质粒（携带MCPyV基因组），37 °C孵育4小时，以将病毒基因组与载体骨架分离（图1）。
2. 向酶切后的DNA中加入1200 µL PB缓冲液（添加10 µL 3 M NaAc，pH 5.2），并通过两个质粒小量纯化离心柱（每个柱子最大结合20 µg DNA）进行纯化。每个柱子用200 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）洗脱酶切后的pR17b质粒DNA。
3. 在50 mL离心管中配制连接反应：加入1.2步骤中获得的纯化质粒DNA 400 µL、8.6 mL 1.05× T4连接酶缓冲液和6 µL高浓度T4 DNA连接酶。16 °C过夜孵育。
4. 向连接反应产物中加入45 mL PB缓冲液（添加10 µL 3 M NaAc，pH 5.2），使用真空泵装置将溶液通过两个质粒小量纯化离心柱。每个柱子用50 µL TE缓冲液洗脱。预期可获得约30 µg DNA。
5. 在傍晚时分，将6 × 10⁶个293TT细胞接种至含DMEM培养基的10 cm培养皿中，培养基中添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺，但不含潮霉素B。
6. 次日上午，确认细胞融合度约为50%。使用66 µL转染试剂（1.1 µL/cm²）、1.4步骤中获得的12 µg重连接MCPyV分离株R17b DNA、8.4 µg ST表达质粒pMtB和9.6 µg LT表达质粒pADL进行转染。
7. 当转染后的细胞接近融合时，于次日用胰蛋白酶消化细胞，并将其转移至15 cm培养皿中继续扩增。
8. 可选：在扩增过程中取少量293TT细胞，进行免疫荧光染色检测MCPyV大T抗原（LT，CM2B4抗体）和VP1（MCV VP1兔源抗体），以评估转染效率。此阶段可观察到细胞核内LT信号，但VP1表达可能尚不可检测。
9. 当15 cm培养皿中的细胞接近融合时（通常为初次转染后5–6天），将细胞转移至三个15 cm培养皿中。当这些15 cm培养皿中的细胞再次接近融合时，收集细胞并按以下病毒收获流程操作。
   注意：可选执行步骤1.8所述的质量控制免疫荧光检测。此阶段大多数细胞应同时呈MCPyV LT和VP1阳性。
10. 收获病毒时，用胰蛋白酶消化细胞，室温下180 × g离心5分钟，弃上清。加入相当于一个细胞沉淀体积的DPBS-Mg（含9.5 mM MgCl₂和1×抗生素-抗真菌剂的DPBS）。随后依次加入25 mM硫酸铵（来自pH 9的1 M储备液）、0.5% Triton X-100（来自10%储备液）、0.1% Benzonase和0.1% ATP依赖性DNase。充分混匀后，37 °C过夜孵育。
11. 将混合物置于冰上孵育15分钟，然后加入0.17倍体积的5 M NaCl。混匀后继续在冰上孵育15分钟。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟。若上清不澄清，轻柔倒置离心管并重复离心步骤。将上清转移至新离心管中。
12. 用含0.8 M NaCl的DPBS以等体积重悬沉淀，按步骤1.11所述再次离心。
13. 合并步骤1.11和1.12所得的上清液，并按步骤1.11所述再离心一次。
14. 在5 mL薄壁聚丙烯离心管中，使用装有长针头的3 mL注射器或p1000移液器，通过底部叠加法依次加入碘克沙醇梯度（27%、33%、39%），每步约0.7 mL。
15. 在已制备好的碘克沙醇梯度上加载3 mL澄清后的含病毒上清液。
16. 在SW55ti转子中，以234,000 × g、16 °C离心3.5小时。加速度和减速度均设为慢速。
17. 超速离心后，在硅化处理的收集管中分12个组分收集梯度液（每组分约400 µL）。
18. 通过dsDNA检测试剂和/或VP1的Western blot（MCV VP1兔源抗体）分析各组分中病毒的存在情况。合并dsDNA和/或VP1含量最高的梯度组分，并通过定量PCR对病毒原液进行表征，以计算病毒基因组当量。将MCPyV病毒颗粒原液保存于-80 °C。

结果

图 1. 利用重组病毒基因组生产 MCPyV 病毒颗粒。 （A）pR17b 质粒（MCPyV 基因组质粒）的质粒图谱。 （B）通过梯度离心收获并纯化的 MCPyV 病毒颗粒样品的代表性图像。箭头指示在梯度核心区域富集的 MCPyV 病毒颗粒条带。 （C）采用 qPCR 定量各梯度组分中的病毒基因组拷贝数。核心梯度组分（编号从梯度顶部开始计数，在图底部标出）。误差线表示三次技术重复的平均值标准误（S.E.M.）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 培养基	Thermo Fisher Scientific	11330-032
重组人 EGF 蛋白，CF	R&D systems	236-EG-200	于 -80 摄氏度保存
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	于 -80 摄氏度保存
CHIR99021	Sigma	SML1046	于 -80 摄氏度保存
IV 型胶原酶	Thermo Fisher Scientific	17104019
Dispase II	Roche	4942078001
抗生素-抗真菌剂	Thermo Fisher Scientific	15240-062	避光保存
DMEM 培养基	Thermo Fisher Scientific	11965084
多聚甲醛	Sigma	P6148
抗 MCPyV LT 抗体 (CM2B4)	Santa Cruz	sc-136172	批号 # B2717
MCV VP1 兔抗血清		兔多克隆血清 #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm