基于CUBIC的蛋白质表达可视化：一种用于全层小鼠皮肤活检样本中蛋白质表达可视化的方法

摘要

来源：Liang, H. 等. CUBIC 协议在全层皮肤样本中以单细胞分辨率可视化蛋白质表达. J. Vis. Exp (2016)

本视频介绍了基于CUBIC的可视化技术，这是一种依赖组织透明化的三维成像技术，可用于对完整皮肤活检样本中的蛋白质表达进行单细胞分辨率的直观评估。该技术方案操作简便，无需制备皮肤切片即可实现皮肤蛋白质的可视化。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 透明小鼠皮肤组织的制备

注意：本研究中使用的所有小鼠均为 C57BL/6 遗传背景

1. 小鼠皮肤组织的采集。
   1. 通过颈椎脱位法人道处死小鼠。
   2. 使用修剪器小心去除目标皮肤区域的毛发，注意避免损伤皮肤。
   3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）中配制的70%乙醇清洗皮肤以去污。
   4. 用镊子提起背部颈区皮肤，并用剪刀做切口。
   5. 解剖获取较大面积的背部小鼠皮肤（约1.5 × 4 cm）。
   6. 将皮肤展平，真皮面朝下置于滤纸上，并标记样本的前后方向。
   7. 沿解剖所得皮肤修剪滤纸，然后将其放入盛有新配制的PBS中4%多聚甲醛（PFA）溶液的15 mL离心管中。
   8. 在室温下固定1小时，或在4 °C冰箱中过夜固定。
   9. 在15 mL离心管中用PBS洗涤皮肤2次，每次5分钟。
      注意：以下步骤（1.1.10–1.1.12）为组织长期保存的可选步骤。
   10. 在15 mL离心管中，使用浓度递增的乙醇（25%、50%、70%）在PBS中对解剖后的皮肤进行脱水处理，每次洗涤1小时，室温操作。
   11. 将脱水后的皮肤保存在含PBS的70%乙醇中，置于15 mL离心管内，4 °C保存直至后续使用。
   12. 在透明化处理前4小时，于15 mL离心管中使用浓度递减的乙醇（70%、50%、25%、0%）在PBS中对皮肤组织进行再水化处理，每次洗涤1小时，室温操作。
2. 小鼠皮肤活检组织的透明化处理
   1. 通过在60–70 °C加热条件下，将3.85 g尿素和3.85 g N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺溶于5.38 mL蒸馏水中，配制CUBIC1透明化溶液。使用加热磁力搅拌器。
   2. 待溶液澄清并冷却至室温后，加入2.31 g聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100。
   3. 用锋利的剃须刀片将小鼠皮肤切成约0.2 × 0.5 cm大小的活检样本，并浸入装有5 mL CUBIC1透明化溶液的15 mL离心管中。为优化毛囊的可视化效果，应确保活检样本的长边沿样本的前后方向切割。
   4. 将离心管置于37 °C杂交炉中的旋转平台上。
   5. 7天后更换透明化溶液。使用前需预先配制新鲜的CUBIC1溶液。
   6. 7天后检查组织的透明度。如有必要，继续将活检样本保留在CUBIC1透明化溶液中，直至组织完全透明。
   7. 当皮肤活检样本完全透明后，移除CUBIC1溶液，并加入4 mL 1× PBS，在37 °C下洗涤组织4次，每次6小时。
   8. 在15 mL离心管中，用含20% w/v蔗糖的PBS溶液在37 °C下洗涤皮肤组织4小时。
   9. 将组织置于包埋剂OCT（Optimal Cutting Temperature Compound）中，放入15 mL离心管，在-80 °C超低温冰箱中过夜冷冻。
      注意：此步骤将提高后续步骤中抗体对活检组织的渗透性。

2. 免疫荧光染色

1. 将组织（步骤 1.2.9）在室温下解冻 2 - 3 小时。
2. 在 15 mL 离心管中用 5 mL PBS 清洗组织，室温下振荡 8 小时，以去除 OCT 包埋剂。
3. 将组织活检样本转移至 2 mL 离心管中，加入 1 mL 兔抗 Keratin14 抗体或兔抗 Ki67 抗体（均用 PBST（PBS + 0.1% Triton-X100）按 1:100 稀释），在 37 °C 培养箱中振荡孵育 3 天。
4. 将组织活检样本转移至 15 mL 离心管中，用 5 mL PBST 在 37 °C 培养箱中振荡清洗 4 次，每次 6 小时。
5. 将组织活检样本转移至 2 mL 离心管中，加入 1 mL Alexa594 标记的抗兔二抗（用 PBST 按 1:100 稀释），在 37 °C 培养箱中振荡孵育 3 天。
6. 将组织活检样本转移至 15 mL 离心管中，用 5 mL PBST 在 37 °C 培养箱中振荡清洗 4 次，每次 6 小时。
7. 将组织活检样本转移至 2 mL 离心管中，加入 1 mL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）核复染溶液（1:1,000 稀释于 PBST 中），在 37 °C 培养箱中振荡孵育过夜。
8. 移除 DAPI 复染液，向 2 mL 离心管中加入 1 mL PBST，在 37 °C 培养箱中振荡清洗 4 次，每次 6 小时。
   注意： 可选步骤：组织活检样本可在含 0.02% 叠氮化钠的 1×PBS 中避光保存，至少可保存 3 周。

3. 成像

1. 配制CUBIC2透明化溶液，其中包含50% (w/v) 蔗糖、25% (w/v) 尿素、10% (w/v) 2,2′,2′′-三羟乙基氨基甲烷和0.1% (v/v) Triton X-100。
2. 将皮肤组织置于2 mL离心管中，加入1 mL CUBIC2溶液，在37 °C培养箱中振荡孵育24小时。此步骤可使组织的折射率均一化。
3. 检查组织的透明度。一旦组织变得透明，将整块皮肤活检样本（0.2 × 0.5 cm）沿其长边放置在玻璃盖玻片上，使毛囊的长度方向与盖玻片表面平行（#1，24 × 60 mm）。
   注意： 可选步骤：经抗体染色的活检样本可在CUBIC2溶液中保存约7天；经Nile Red染色的活检样本在CUBIC2溶液中最多只能保存1天，应尽快成像。
4. 制备成像室（图1).
   ​注意： 成像室制备所需的耗材包括：蓝丁胶、橡皮泥或类似材料，以及2片盖玻片（24 × 50 mm）图1A).
   1. 准备两条细长的蓝色橡皮泥条（直径约 1 mm × 2 cm），以及两块盖玻片（图1B).
   2. 在一张盖玻片上放置蓝色橡皮泥条，预留出足够的空间用于皮肤活检图1C，步骤 3.4.3）。
   3. 将皮肤活检组织置于盖玻片上两层条带之间的 CUBIC2 溶液液滴中（图1C).
   4. 用第二块盖玻片覆盖皮肤活检样本（图1D).
5. 将装有皮肤活检组织的成像腔室置于共聚焦显微镜载物台上，并移动组织至光路中。
6. 使用汞灯或卤素光源以及标准的落射荧光滤光片扫描样品（例如， DAPI/GFP/CY3/CY5）以鉴定荧光标记的目标区域。
7. 使用10倍和20倍物镜（NA 0.75）以及标准共聚焦荧光成像技术选取图像感兴趣区域（例如，DAPI 染色样品使用 405 nm 激光激发，并收集 425–475 nm 范围内的荧光信号；Alexa Fluor 594 或 Nile Red 染色样品使用 561 nm 激光激发，并收集 570–620 nm 范围内的荧光信号。
8. 使用显微镜Z轴层扫图像采集软件，对每个感兴趣区域生成图像Z轴层扫数据例如，使用下文所述的NIS Elements成像软件4.13版本。
   1. 确保激光功率处于最佳状态，并选择合适的PMT高压/偏移设置以采集样品荧光。
   2. 打开 "ND采集" 工具栏来自 "采集控制".
   3. 选择 "Z系列设置" 标签（确保所有其他标签均未选中）。
   4. 扫描过程中，将焦距对准样品顶部并按下 "顶部" 按钮
   5. 聚焦于样品底部并按下 "底部" 按钮
   6. 输入所需的步长（或点击优化步长按钮）。
   7. 按压 "立即运行" 按钮。
   8. 将得到的Z轴层叠图像保存为单独的Tiff图像栈（每幅图像栈对应一种荧光染料）。
9. 使用图像Z轴堆栈，通过3D分析软件重建感兴趣区域的三维体积例如，使用 Imaris x64 7.2.3 进行分析，具体方法如下所述。
   1. 启动分析软件。
   2. 选择 "超越" 工具栏中的按钮用于生成三维体积图像。
   3. 打开第一个彩色图像Z轴序列（Z-stack）例如，DAPI）。
   4. 使用“添加通道”工具添加额外的颜色通道，每种荧光染料对应一个通道。因此，含有 DAPI 和 Alexa Fluor 594 荧光染料的样本需要两个通道。
   5. 使用 "图像属性" 用于设置正确的像素（体素）尺寸（XYZ），具体参数依据上述步骤 3.7 确定。
   6. 使用 "显示调节" 根据需要更改通道颜色的工具（例如， 将DAPI通道设为蓝色，Alexa Fluor 594通道设为红色。
   7. 在图像窗口中调整三维图像的位置时，可根据需要使用计算机鼠标点击并拖动图像。
   8. 使用 "快照" 使用工具栏中的工具生成3D图像的屏幕截图。
   9. 使用 "动画" 使用工具栏中的工具生成三维样本旋转的动画。

结果

图1：成像腔室的制备。A：制备成像腔室所需的耗材包括蓝丁胶、彩泥或类似材料，以及两张盖玻片（24 × 50 mm）。B：准备两条细长的蓝丁胶条（直径约2 mm × 2 cm），以及两张盖玻片。C：将蓝丁胶条贴在一张盖玻片上，留出足够空间放置皮肤活检样本；将皮肤活检样本置于两胶条之间的CUBIC2溶液液滴中。D：将第二张盖玻片盖在蓝丁胶条上，覆盖皮肤活检样本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6418
96% 乙醇（未变性）	Chem-supply	UN1170
4&rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚<br/> (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-四(2-羟丙基)乙二胺	Merck Millipore	821940
聚乙二醇单对异辛基苯基醚	Merck Millipore	648462
吐温 X-100	Merck Millipore	648462
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
最佳切割温度<br/> (OCT) 包埋剂	Tissue-Tek	4583
抗角蛋白14抗体	Covance	PRB-155P
抗Ki67抗体	Abcam	ab16667
驴抗兔Alexa 594	Life Technologies	A21207
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
尿素	Merck Millipore	66612
2,2&prime;,2&prime;&rsquo;-氮川三乙醇	Merck Millipore	137002
共聚焦显微镜	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - 共聚焦显微镜
cruZer6 面部修剪器	Braun	Braun cruZer6 Face
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	438456