原代人角质形成细胞的基因修饰：利用重组逆转录病毒进行角质形成细胞基因操作的方法

摘要

来源：Li, J. 等。利用去细胞化人真皮构建基因修饰的类器官皮肤培养模型。J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了一种利用重组逆转录病毒制备基因修饰的原代人角质形成细胞的详细实验方案。该方法可用于调控角质形成细胞中的基因表达。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 基因改造原代人角质形成细胞

注意：使用在完全 DMEM 培养基 [DMEM + 10% 胎牛血清 (FBS) + 青霉素/链霉素] 中培养的双嗜性 phoenix 细胞来产生用于感染原代人角质形成细胞的病毒。编码如 gag-pol 和包膜蛋白等病毒包装基因已稳定整合至 phoenix 细胞基因组中，因此在转染逆转录病毒载体后可实现病毒的产生。phoenix 细胞可实现高效转染，从而产生高滴度病毒。该包装系统产生的病毒还可感染包括人类在内的多种哺乳动物细胞。

1. 第1天：转染前一天，将Phoenix细胞以每孔800,000个细胞的密度接种于6孔板中，使用完全DMEM培养基。
2. 第2天：进行转染，每孔使用3 μg逆转录病毒载体。将3 μg逆转录病毒载体分装至1.5 mL离心管中。每3 μg载体使用100 μL DMEM加6 μL转染试剂的混合液。在1.5 mL离心管中将6 μL转染试剂与100 μL DMEM混合。（所用逆转录病毒载体见设备/材料表）
   1. 室温孵育5分钟，然后将106 μL混合液加入预先分装有3 μg逆转录病毒载体的离心管中。混匀后室温孵育30分钟。将此全部混合物逐滴加入Phoenix细胞的各孔中。
3. 第3天：转染后一天，吸除Phoenix细胞的培养基，每孔加入2 mL新鲜完全DMEM培养基。同一天，将原代人角质形成细胞以每孔75,000个细胞的密度接种至6孔板中。使用无血清角质形成细胞培养基（KCSFM）并添加抗生素（青霉素/链霉素）培养角质形成细胞。
   注意： 原代人角质形成细胞为外购获得。细胞可从多家供应商处购买（详见材料表）。
4. 第4天：收集转染后的Phoenix细胞培养上清液（现含有病毒颗粒）。使用注射器将上清液通过0.45 μm滤器过滤（以去除可能污染的Phoenix细胞），每孔角质形成细胞（前一天接种，75,000个细胞/孔）加入2 mL滤过上清液。在培养基中加入六亚甲基溴化铵（5 μg/mL），以促进感染过程。病毒滴度约为1 × 10⁷ TU/mL。
   1. 将6孔板在室温下以200 × g离心1小时。离心后吸除含病毒的培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，然后加入KCSFM培养基。
5. 第5天：同第4天操作，再次使用含六亚甲基溴化铵（5 μg/mL）的2 mL滤过上清液感染同一批角质形成细胞。在室温下以200 × g离心1小时，吸除含病毒的培养基，用1× PBS洗涤一次，然后加入KCSFM培养基。
   注意： 若逆转录病毒载体携带可筛选标记，可使用药物筛选角质形成细胞，并扩增用于后续分析或应用（如类器官培养）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双嗜性凤凰细胞系	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 转染试剂	Promega	E2691
角质形成细胞培养基（KCSFM）	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
人新生儿角质形成细胞	ATCC	PCS-200-010
人新生儿角质形成细胞	Cell Applications	102K-05n
MSCV 逆转录病毒载体	Clontech	634401
LZRS 逆转录病毒载体	Addgene
pSuper.Retro.Puro 逆转录病毒 载体	Oligoengine	VEC-PRT-0002
六亚甲基溴化铵	Sigma	H9268-5G
FBS	GIBCO	10437-028
青霉素/链霉素	GIBCO	15140-122