原代人角质形成细胞的基因改造:一种使用重组逆转录病毒对角质形成细胞进行基因作的方法

Abstract

来源:Li， J. et al. 使用失活的人类真皮生成转基因器官型皮肤培养物。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频描述了生产转基因原代人角质形成细胞重组逆转录病毒的详细方案。该方法可用于纵角质形成细胞中的基因表达。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 基因修饰原代人角质形成细胞

注意:使用在完整的 DMEM 培养基 [DMEM + 10% 胎牛血清 （FBS） + 笔/链球菌] 中生长的两嗜性凤凰细胞产生病毒来感染原代人角质形成细胞。编码 gag-pol 和包膜等蛋白质的病毒包装基因稳定整合到 phoenix 细胞基因组中，从而在转染逆转录病毒载体时产生病毒。Phoenix 细胞可以高效转染，从而产生高病毒滴度。该包装线生产的病毒还可以感染包括人类在内的多种哺乳动物细胞。

1. 第 1 天:转染前一天，将 Phoenix 细胞以每孔 800,000 个细胞的密度接种到完整的 DMEM 培养基中，以每孔 800,000 个细胞的密度接种。
2. 第 2 天:转染当天，每孔使用 3 μg 逆转录病毒载体。将 3 μg 逆转录病毒载体分装到 1.5 mL 试管中。每 3 μg 载体使用 100 μL DMEM 和 6 μL 转染试剂的混合物。在 1.5 mL 试管中混合 6 μL 转染试剂和 100 μL DMEM。（使用的逆转录病毒载体列在设备/材料表中）
   1. 孵育 5 分钟，并将 106 μL 混合物加入含有 3 μg 逆转录病毒载体的预分装管中。混....

Materials