角质形成细胞克隆形成实验：一种评估角质形成细胞体外克隆生长能力的实验方法

摘要

来源：Morris, R. J. 等. 小鼠表皮角质形成细胞的分离及其 体外 克隆形成培养. 视频实验杂志 (2019)

在本视频中，我们对从成年小鼠分离的角质形成细胞进行克隆形成实验，以评估单个细胞增殖并形成克隆的能力。该角质形成细胞分离技术可用于研究皮肤化学致癌及肿瘤促进作用的其他下游环节。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 原代角质形成细胞的分离与接种

1. 根据批准的动物设施/IACUC标准，通过CO₂ 吸入法安乐死四至五只成年雌性小鼠。然而，本方案也可用于单只雌性或雄性小鼠。
   1. 使用电动动物剪刀剪去约9 cm² 背部毛发，并将所有剪毛后的小鼠放入一个500 mL的广口瓶中，加入足量聚维酮碘消毒液（非擦洗用），使其完全浸没小鼠，持续1-2分钟。充分摇晃广口瓶，使消毒液均匀覆盖小鼠体表。
   2. 倒出消毒液，用清水冲洗至流出液体澄清。重复一次相同的消毒液清洗，随后再用清水冲洗。碘溶液消毒后，将所有小鼠浸泡于70%乙醇中5-10分钟。
      注意： 浅色毛发小鼠（如BALB/c）经碘消毒清洗后会保留轻微黄色，而深色毛发小鼠（如C57BL/6）则不会。值得注意的是，细胞活力或培养生长不受此黄色影响。
2. 在超净工作台中使用镊子和剪刀小心剥离剪毛后的背部皮肤。将切除的背部皮肤置于装有PBS/2倍庆大霉素的锥形管中。避免使用腹侧皮肤，以防乳腺细胞污染培养物。
3. 使用已灭菌的镊子和手术刀，每次将一片背部皮肤毛面朝下放置于一个薄壁培养皿上。从皮肤....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝，1×，溶于0.9%生理盐水	Life Technologies Gibco	15250-061
1.5 英寸带枢轴环的磁力搅拌子	Bel-Art, Wayne	371101128	置于 2 盎司 Nalgene 瓶中
10 mL 一次性移液管	BD Falcon	357551
150 cm² (T-150) 培养瓶	Corning	430825
2 盎司 Nalgene 瓶	Thermo Fisher Scientific	2118-0002	60 mL
2.5% 胰蛋白酶溶液，10×	Life Technologies Gibco	15090-046
50 mL 无菌锥形管	BD Falcon	352098
细胞筛，70 µm，无菌	BD Discovery Labware	352350
牛I型胶原蛋白，30 mg	BD Biosciences	354231
新鲜制备的 Milli-Q 去离子水			新鲜配制；经两次蒸馏的反渗透水
Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺’	Life Technologies Gibco	14190-144	无菌
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）	ATCC	30-2002
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific Hyclone		SH 300070.03
庆大霉素，50 mg/10 mL	Life Technologies Gibco	15750-060
22 号无菌不锈钢刀片	BD Bard-Parker	371222
4 号手术刀柄	Biomedical Research Instruments	26-1200	置于盛有 70% 乙醇的杯中
一把剪刀	Biomedical Research Instruments	25-1050	置于盛有 70% 乙醇的杯中
一把有齿镊	Militex	6-Apr	置于盛有 70% 乙醇的杯中
方形无菌塑料培养皿	BD Falcon	351112
Swiss 小鼠 3T3 成纤维细胞	ATCC	CCL-92	传代次数不超过 10 代
Williams E 培养基	Life Technologies Gibco	12551-032
SMEM：无钙镁的最低必需培养基，用于悬浮培养	Life Technologies Gibco	11380-037