来源：Morris, R. J. 等. 小鼠表皮角质形成细胞的分离及其 体外 克隆形成培养. 视频实验杂志 (2019)
在本视频中，我们对从成年小鼠分离的角质形成细胞进行克隆形成实验，以评估单个细胞增殖并形成克隆的能力。该角质形成细胞分离技术可用于研究皮肤化学致癌及肿瘤促进作用的其他下游环节。
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方法文章
角质形成细胞克隆形成实验：一种评估角质形成细胞体外克隆生长能力的实验方法
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 原代角质形成细胞的分离与接种
- 根据批准的动物设施/IACUC标准，通过CO2 吸入法安乐死四至五只成年雌性小鼠。然而，本方案也可用于单只雌性或雄性小鼠。
- 使用电动动物剪刀剪去约9 cm2 背部毛发，并将所有剪毛后的小鼠放入一个500 mL的广口瓶中，加入足量聚维酮碘消毒液（非擦洗用），使其完全浸没小鼠，持续1-2分钟。充分摇晃广口瓶，使消毒液均匀覆盖小鼠体表。
- 倒出消毒液，用清水冲洗至流出液体澄清。重复一次相同的消毒液清洗，随后再用清水冲洗。碘溶液消毒后，将所有小鼠浸泡于70%乙醇中5-10分钟。
注意： 浅色毛发小鼠（如BALB/c）经碘消毒清洗后会保留轻微黄色，而深色毛发小鼠（如C57BL/6）则不会。值得注意的是，细胞活力或培养生长不受此黄色影响。
- 在超净工作台中使用镊子和剪刀小心剥离剪毛后的背部皮肤。将切除的背部皮肤置于装有PBS/2倍庆大霉素的锥形管中。避免使用腹侧皮肤，以防乳腺细胞污染培养物。
- 使用已灭菌的镊子和手术刀，每次将一片背部皮肤毛面朝下放置于一个薄壁培养皿上。从皮肤组织腹侧开始刮除所有皮下组织（包括脂肪），直至皮肤呈半透明状。尽量彻底清除皮下组织，但避免撕裂皮肤（毛囊部分）。同时，避免长时间刮擦，并防止皮肤干燥。
- 将刮除后的皮肤保存在PBS溶液中，待其余皮肤处理完毕。然后使用手术刀将皮肤切成0.5 cm × 1-1.5 cm的条状，并将毛面朝上放置于无菌培养皿中。
- 小心地将20 mL PBS/2倍庆大霉素溶液与胰蛋白酶（0.25%）混合后，用移液器加入100 mm × 20 mm塑料培养皿中。使用无菌镊子将皮肤条转移至胰蛋白酶溶液表面，毛面朝上，于32 °C培养箱中孵育2小时。
注意： 胰蛋白酶消化的时间和温度对于获得高可培养性的原代角质形成细胞至关重要。尽管其他方法可能获得较高活力的细胞产量，但角质形成细胞的可培养性往往较差。- 在2小时孵育期间，对培养皿进行胶原包被，并置于37 °C孵育1小时（见步骤1.1.2）。对于克隆形成实验，60 mm培养皿需在角质形成细胞收获前24小时进行包被，以便经X射线照射的3T3饲养层细胞能够贴附并均匀铺展于底部。
注意： 克隆培养中培养皿的包被对于小鼠表皮角质形成细胞的正常贴附、克隆形成及最终生长/增殖至关重要。
- 在2小时孵育期间，对培养皿进行胶原包被，并置于37 °C孵育1小时（见步骤1.1.2）。对于克隆形成实验，60 mm培养皿需在角质形成细胞收获前24小时进行包被，以便经X射线照射的3T3饲养层细胞能够贴附并均匀铺展于底部。
- 表皮刮取步骤：准备一个无菌塑料方形培养皿，倾斜30°角，以便使用15 mL收获培养基（见表1）进行适当的表皮刮取。用弯头镊子小心从胰蛋白酶溶液中取出一片漂浮的皮肤条，然后使用新的手术刀片将表皮和毛发刮入培养基中。
- 刮取时不要施加过大力量，但应施加足够力量以刮下表皮，同时避免影响细胞活力。
- 刮取表皮时，保持刀片与皮肤片垂直。若刀片倾斜朝向移动方向，则更容易撕裂皮肤；若刀片倾斜背离移动方向，则更可能导致表皮去除不完全。
- 小心将含有刮取表皮细胞的收获培养基倒入一个无菌60 mL广口瓶（可高压灭菌且可重复使用）中，瓶内预先放入一根1.5英寸磁力搅拌子。用额外的收获培养基冲洗培养皿，以收集残留的表皮细胞，并将最终体积补至30 mL。使用磁力搅拌器在室温下以100 rpm搅拌20分钟。此过程可使被困在毛发中的表皮细胞释放出来。
- 将无菌70 µm细胞筛置于50 mL锥形管顶部。该细胞筛可稳固地放置在50 mL锥形管上。
- 将广口瓶移入生物安全柜中。取出搅拌子，并将内容物倒入连接在50 mL锥形管上的筛网过滤器中，滤除不需要的毛发和角质层碎片。
- 按压筛网内的毛发及角质层物质，促使其释放被困的细胞。使用5 mL收获培养基冲洗，使剩余被困细胞释放并流入管中。最终将锥形管中的总体积补至50 mL。
- 盖紧装有细胞滤液的50 mL锥形管，于4 °C条件下以160 × g 离心7分钟。随后吸除上清液，加入5 mL收获培养基。最后用5 mL移液器轻轻吹打约20次，重悬细胞沉淀。
- 此步骤中，将细胞置于冰盒中以防止聚集。随后加入25 mL收获培养基，再次吹打20-25次。
- 为在此步骤准确计数角质形成细胞，取1 mL细胞悬液加入19 mL收获培养基。此时细胞稀释比例为1:20，总体积为50 mL锥形管。若角质形成细胞来自单只小鼠，则需调整细胞悬液体积。例如，不使用30 mL，而使用15 mL，并进行1:10稀释以进行细胞计数。
- 从50 mL锥形管（1:20稀释）中吸取0.5 mL稀释后的细胞，转移至一个1.5 mL已灭菌的微量离心管中。取0.2 mL（200 µL）细胞混合液至另一支1.5 mL微量离心管中，加入等体积（200 µL）的0.4%台盼蓝溶液。轻轻混合3次后，将细胞转移至血细胞计数板，计数有核角质形成细胞。
- 所有呈深蓝色、台盼蓝染色阳性的细胞记为非活细胞（死亡细胞），而较小的金黄色或粉红色细胞记为活细胞。因此，每只小鼠最终角质形成细胞产量应约为3000万个活细胞。
- 将原始50 mL锥形管（来自步骤1.8）在4 °C条件下以160 × g 离心7分钟。此步骤中，将细胞重悬于所需培养基中，并配制适当的稀释液用于接种细胞。
- 对于大规模培养，每35 mm培养皿接种200万至400万个活的金黄色细胞，使用细胞培养基（KGM型培养基+补充剂，用于单层培养）（见 表1）。对于克隆形成（克隆生成）实验，每60 mm培养皿接种1000个细胞，置于经X射线照射的瑞士小鼠3T3饲养层上，使用胶原包被的培养皿及含补充剂和血清的改良Williams E培养基。
- 35 mm和60 mm培养皿分别使用总共2至4 mL培养基。此外，从ATCC采购的DMEM和Williams E培养基应配制为低碳酸氢钠浓度，以便在5% CO2条件下使用。
- 将培养细胞（大规模或克隆形成）置于32 °C、95%湿度、5% CO2条件下培养。大规模培养在初次接种后一天更换培养基，之后每周更换三次。而对于克隆实验，首次换液在细胞接种后两天进行，之后每周更换三次。
- 对于克隆培养，分别在两周和四周时间点进行培养。克隆培养结束后（2周或4周），吸除培养基。在室温下用10%缓冲福尔马林固定克隆过夜，随后用0.5%罗丹明B水溶液（灭菌水配制）染色1小时。然后从培养皿边缘用移液器吸除罗丹明B染液。
- 用冷的灭菌水冲洗培养皿，直至冲洗液澄清。将培养皿倾斜放置于皿盖上，使其干燥，以便最终进行克隆计数。值得注意的是，在进行克隆形成实验时，切勿接种<1 mL的细胞悬液。若细胞浓度过高，应进行系列稀释。
| 溶液与培养基 | 备注 |
| 收获溶液 | |
| 2.5% 胰蛋白酶（5 mL） | |
| Dulbecco's PBS（500 mL） | |
| 庆大霉素（2 mL） | |
| 含2倍庆大霉素的PBS（45 mL） | |
| 含2倍庆大霉素的磷酸盐缓冲液（PBS） | |
| 胰蛋白酶溶液 | |
| 细胞培养溶液 | |
| 用于包被培养皿的Purecol-纤连蛋白溶液： | |
| 1 M HEPES（1 mL） | |
| 116 mM CaCl₂（1 mL） | |
| 牛血清白蛋白 1.0 mg/mL（10 mL） | |
| 细胞培养基（100 mL） | |
| 纤连蛋白（1 mg） | |
| Purecol 胶原蛋白（1 mL） | |
| 细胞冻存溶液 | |
| DMSO（2 mL） | |
| 含10% BCS及青霉素-链霉素的DMEM | |
| 收获培养基 | 必须不含钙离子 |
| 2倍庆大霉素（1 mL） | |
| FBS（50 mL） | |
| SMEM（500 mL） | |
| 高钙Williams' E培养基，含以下成分： | |
| EGF（5 µg/mL）1 mL | |
| 谷氨酰胺 14.5 mL | |
| 氢化可的松（1 mg/mL）0.5 mL | |
| 胰岛素 1 mL | |
| LinoAcid-BSA（0.1 mg/mL）0.5 mL | |
| MEM必需氨基酸 4 mL | |
| MEM维生素 5 mL | |
| 青霉素-链霉素 5 mL | |
| 转铁蛋白（5 mg/mL）1 mL | |
| 维生素A（1 mg/1,000 µL）57.5 µL | |
| 维生素E 1 mg/mL（4°C） 3.5 µL | |
| 维生素D₂（10 mg/mL）50 µL | |
| 3T3成纤维细胞完全生长培养基（CGM） | |
| BCS（100 mL） | |
| DMEM（900 mL） | |
| 青霉素-链霉素（10 mL） | |
| KGM | 用于大规模培养的培养基，为低钙培养基 |
| Morris 2培养基，添加与Williams' E相同的补充物 | Williams E的低钙变体，含补充物 |
表1：溶液与培养基配方。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 台盼蓝，1×，溶于0.9%生理盐水 | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1.5 英寸带枢轴环的磁力搅拌子 | Bel-Art, Wayne | 371101128 | 置于 2 盎司 Nalgene 瓶中 |
| 10 mL 一次性移液管 | BD Falcon | 357551 | |
| 150 cm² (T-150) 培养瓶 | Corning | 430825 | |
| 2 盎司 Nalgene 瓶 | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% 胰蛋白酶溶液，10× | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 50 mL 无菌锥形管 | BD Falcon | 352098 | |
| 细胞筛，70 µm，无菌 | BD Discovery Labware | 352350 | |
| 牛I型胶原蛋白，30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| 新鲜制备的 Milli-Q 去离子水 | 新鲜配制；经两次蒸馏的反渗透水 | ||
| Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺’ | Life Technologies Gibco | 14190-144 | 无菌 |
| Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM） | ATCC | 30-2002 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| 庆大霉素，50 mg/10 mL | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| 22 号无菌不锈钢刀片 | BD Bard-Parker | 371222 | |
| 4 号手术刀柄 | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | 置于盛有 70% 乙醇的杯中 |
| 一把剪刀 | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | 置于盛有 70% 乙醇的杯中 |
| 一把有齿镊 | Militex | 6-Apr | 置于盛有 70% 乙醇的杯中 |
| 方形无菌塑料培养皿 | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss 小鼠 3T3 成纤维细胞 | ATCC | CCL-92 | 传代次数不超过 10 代 |
| Williams E 培养基 | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| SMEM：无钙镁的最低必需培养基，用于悬浮培养 | Life Technologies Gibco | 11380-037 |
