基于miniCoopR载体的转基因技术：一种在斑马鱼肿瘤模型中筛选黑色素瘤诱导基因的方法

摘要

来源：Iyengar, S. 等. 利用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因. 视觉化实验杂志 (2012)

本视频介绍了一种利用转基因斑马鱼肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因的方法。当注射黑色素瘤诱导型miniCoopR载体后，斑马鱼会发展出黑色素瘤，因此可用于研究影响斑马鱼肿瘤发育的遗传因素。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 黑色素瘤发病调控因子的筛选

1. 通过PCR扩增目的基因（GOI）的全长开放阅读框，并使用BP Clonase II（Invitrogen）将其重组至pDONR 221中，构建Gateway中间入门克隆。利用Multisite Gateway技术（Invitrogen）将p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA和miniCoopR进行重组，使目的基因置于miniCoopR载体中的mitfa启动子下游（图1A）。
2. 将每种克隆的25皮克与25皮克Tol2转座酶mRNA共同注射到单细胞期的Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)三重纯合斑马鱼胚胎中，操作方法如前所述。将注射后的胚胎在28.5 °C条件下培养，并于24 hpf时移除死亡胚胎。
3. 在72 hpf时，通过将含有注射胚胎的培养皿置于解剖显微镜下，在白色背景的透射光或反射光条件下观察，筛选出黑色素细胞表型得到恢复的转基因个体（图1A）。
4. 在4 dpf时，将筛选出的个体转移至斑马鱼养殖设施的育苗区3 L水箱中继续饲养。
5. 在2个月龄时，选择至少存在一个面积大于4 mm²的黑色素细胞恢复区域的个体（图1A）。72 hpf时黑色素细胞恢复程度与2个月时的恢复程度之间存在显著相关性。若在72 hpf时挑选出具有黑色素细胞恢复的胚胎，则其中大多数（约80%）在2个月时将至少存在一个面积大于4 mm²的恢复区域。
6. 每周对筛选出的个体进行肿瘤发生情况的监测（图1B）。组织病理学变化与形态学变化之间存在高度相关性。当病变部位隆起于动物体表时，即可识别为从良性向恶性转变的形态学特征。将携带肿瘤的个体分离出来用于后续研究。
7. 绘制无黑色素瘤生存曲线，横坐标为周龄，纵坐标为无黑色素瘤生存率。将表达目的基因的黑色素细胞个体与在黑色素细胞中表达EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的对照个体进行比较（图1C）。注射miniCoopR-EGFP的个体中位肿瘤发生时间约为18周。采用log-rank检验判断两条生存曲线是否存在统计学差异。

结果

图1. 利用miniCoopR实验筛选黑色素瘤起始修饰因子。A) miniCoopR实验示意图。携带miniCoopR载体及目的基因、黑色素细胞得到挽救的胚胎（箭头所示）。比例尺 = 250 μM。黑色素细胞挽救面积大于4 mm²的成年斑马鱼（箭头所示）。比例尺 = 500 μM。B) 经miniCoopR-EGFP挽救的斑马鱼，其体内出现一个无色素性肿瘤和一个有色素性肿瘤（箭头所示）。C) 表达癌基因SETDB1与对照EGFP基因的肿瘤之间黑色素瘤无病生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gateway 重组试剂	Invitrogen
miniCoopR
Mitfa 抗体
FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体	Invitrogen
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Casper 斑马鱼
701N 10 μl 注射器	Hamilton/Fisher	14-824
40 μM 滤膜	BD Falcon/Fisher	352340
FBS	Invitrogen	26140079