基于 miniCoopR 载体的转基因:一种在斑马鱼肿瘤模型中筛选黑色素瘤诱导基因的技术

所有涉及动物的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 黑色素瘤发作调节剂筛查

1. 通过 PCR 创建 Gateway 中间进入克隆，扩增目标基因 （GOI） 的全长开放阅读框，并使用 BP 克隆酶 II （Invitrogen） 重组到 pDONR 221 中。使用多位点网关技术 （Invitrogen） 重组 p5E_mitfa、pME_GOI、Tol2kit #302 p3E_SV40polyA 和 miniCoopR，将目标基因置于 miniCoopR 载体中的 mitfa 启动子下（图 1A）。
2. 将每个克隆的 25 皮克以及 25 皮克 Tol2 转座酶 mRNA 注射到单细胞 Tg （mitfa:BRAFV600E） 中;第 53 页（LF）;如前所述，mitfa（lf） 三重纯合斑马鱼胚胎。在 28.5 °C 下孵育注射的胚胎。在 24 hpf 下去除任何死胚胎。
3. 通过将含有注射胚胎的培养皿放在解剖显微镜上，在白色背景下的入射光下，选择具有 72 hpf 拯救的黑色素细胞的转基因动物（图 1A）。
4. 以 4 dpf 将动物转移到斑马鱼设施苗圃中的 3 L 水箱中。
5. 在 2 个月时，选择至少有一个黑色素细胞拯救面积大于 4 mm² 的动物（图 1A）。72 hpf 时的黑素细胞挽救程度与 2 个月时的黑素细胞挽救程度之间存在很强的相关性。当以 72 hpf 的速度挑选具有黑色素细胞拯救的胚胎时，其中大多数 （~80%） 在 2 个月时至少有一个黑色素细胞拯救区域大于 4 mm²。
6. 每周筛选选定的动物是否存在肿瘤（图 1B）。组织病理学和形态学变化之间存在很强的相关性。当病变从动物表面凸起时，从良性向恶性的转变被认为是一种形态学变化。分离荷瘤动物进行研究。
7. 在横坐标上绘制无黑色素瘤生存曲线，以周为单位，在纵坐标上绘制无黑色素瘤生存率。将具有表达目标基因的黑色素细胞的动物与在黑色素细胞中表达 EGFP（增强的绿色荧光蛋白）的对照动物进行比较（图 1C）。注射 miniCoopR-EGFP 的动物的中位肿瘤发作约为 18 周。使用对数秩检验确定两条曲线在统计上是否存在差异。

图 1.使用 miniCoopR 测定法筛选黑色素瘤发病修饰剂。A） miniCoopR 检测示意图。具有拯救的黑色素细胞（箭头）的胚胎，含有 miniCoopR 载体和目标基因。比例尺 = 250 μM。大于 4 mm2 的黑色素细胞拯救（箭头）的成人。比例尺 = 500 μM B） MiniCoopR-EGFP 拯救了患有黑色素瘤和色素沉着肿瘤（箭头）的斑马鱼。C） 比较表达癌基因 SETDB1 的肿瘤和对照 EGFP 基因的代表性无黑色素瘤生存曲线 （p = 9.4×10-7，对数秩 χ2）。