抗体染色检测鳞片黑素细胞：一种用于检测斑马鱼模型背鳞相关黑素细胞中转录因子表达的技术

摘要

来源：Sharanya Iyengar 等. 利用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因. J. Vis. Exp. (2012)

本视频介绍了用于检测斑马鱼模型背部鳞片相关黑素细胞中转录因子表达的抗体染色方法。该免疫染色技术有助于在转基因斑马鱼中特异性鉴定黑素细胞诱导型转染因子-A。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审核。

1. 鳞片黑色素细胞的抗体染色

1. 配制 PO₄ 含80 mL 0.1 M Na的缓冲液₂HPO₄ 和 20 mL 0.1 M NaH₂PO₄确保pH为7.3。配制2×固定缓冲液，包含8.0 g蔗糖、0.15 mL 0.2 M CaCl₂。₂，以及 90 mL 0.2 M PO₄ 缓冲液，pH 7.3。如有必要，用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.3，然后用 PO 补足至 100 ml₄ 缓冲液
2. 称取最多300 mg固体PFA，加入微量离心管中。加入5 mM NaOH，其体积（μL）等于PFA质量（mg）的4.5倍（例如 450 微升 5 mM NaOH 加入 100 毫克 PFA 中。在 60–70 °C 加热，期间偶尔摇动，直至 PFA 完全溶解。离心去除残余不溶物，收集 20% PFA 上清液。每次使用前新鲜配制。
3. 配制含有1×固定缓冲液和4% PFA的固定液。
4. 用0.17 mg/mL的三卡因麻醉鱼类。
5. 使用解剖显微镜下的透射光，用尖端精细的镊子拔取背部鳞....

结果

图1. 鳞片黑素细胞的抗体染色。A) 从麻醉的miniCoopR-EGFP斑马鱼上拔取鳞片。B) 含有色素化黑素细胞的未漂白鳞片，以及C) 来自miniCoopR-EGFP斑马鱼的漂白鳞片。比例尺 = 100 μM。未漂白鳞片经D) Mitfa抗体和E) DAPI染色。漂白鳞片经F) Mitfa抗体和G) DAPI染色。比例尺 = 40 μM。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gateway 重组试剂	Invitrogen
miniCoopR
Mitfa 抗体
FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体	Invitrogen
Vectashield	Vector Labs	H-1000
casper 斑马鱼
701N 10 μl 注射器	Hamilton/Fisher	14-824
FBS	Invitrogen	26140079