抗体染色检测鳞片黑素细胞：一种用于检测斑马鱼模型背鳞相关黑素细胞中转录因子表达的技术

摘要

来源：Sharanya Iyengar 等. 利用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因. J. Vis. Exp. (2012)

本视频介绍了用于检测斑马鱼模型背部鳞片相关黑素细胞中转录因子表达的抗体染色方法。该免疫染色技术有助于在转基因斑马鱼中特异性鉴定黑素细胞诱导型转染因子-A。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审核。

1. 鳞片黑色素细胞的抗体染色

1. 配制 PO₄ 含80 mL 0.1 M Na的缓冲液₂HPO₄ 和 20 mL 0.1 M NaH₂PO₄确保pH为7.3。配制2×固定缓冲液，包含8.0 g蔗糖、0.15 mL 0.2 M CaCl₂。₂，以及 90 mL 0.2 M PO₄ 缓冲液，pH 7.3。如有必要，用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.3，然后用 PO 补足至 100 ml₄ 缓冲液
2. 称取最多300 mg固体PFA，加入微量离心管中。加入5 mM NaOH，其体积（μL）等于PFA质量（mg）的4.5倍（例如 450 微升 5 mM NaOH 加入 100 毫克 PFA 中。在 60–70 °C 加热，期间偶尔摇动，直至 PFA 完全溶解。离心去除残余不溶物，收集 20% PFA 上清液。每次使用前新鲜配制。
3. 配制含有1×固定缓冲液和4% PFA的固定液。
4. 用0.17 mg/mL的三卡因麻醉鱼类。
5. 使用解剖显微镜下的透射光，用尖端精细的镊子拔取背部鳞片，注意不要损伤含有黑色素细胞的鳞片半部图1A）。用镊子将鳞片直接放入1 mL固定液中，室温下旋转孵育不少于2小时。将鱼转移至养鱼用水中，观察鱼的状态以确认其成功恢复。
6. 为漂白有色素的黑色素细胞，将固定的鳞片在PBST（1× PBS，pH 7.4，0.1% Triton X-100）中室温洗涤2次，每次5分钟。加入1 mL新配制的漂白液，其中含0.4 mL 10% KOH和0.15 mL 30% H₂O₂ 在5 mL dH₂O中₂O. 用封口膜或管盖锁住管口，防止气体将管子冲开。继续漂白至色素完全消失（通常为10分钟）图1B，C）。在室温下用PBST洗涤四次，每次5分钟。
7. 在阻断液中孵育至少 30 分钟，阻断液成分为 1x PBS pH 7.4、0.2% Triton X-100、2 mg/mL BSA、1% DMSO、0.02% NaN₃，以及2% 羊血清。不要加入NaN₃ 如果使用 HRP 反应进行显色。
8. 在封闭液中室温孵育一抗，过夜。样本上液体体积需至少为 400 μL，以确保样本完全浸没。
9. 用PBST在室温下清洗鳞片，每次30分钟，共清洗3次。
10. 在室温下用封闭液孵育二抗，时间从2小时至过夜。
11. 用含0.1 μM DAPI的PBST染色10分钟。
12. 用 PBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
13. 将鳞片置于载玻片上的一滴Vectashield封片剂中，使鳞片的凹面朝下贴近载玻片，然后盖上盖玻片。用透明指甲油密封载玻片边缘，并在荧光显微镜下观察标本。图1D、E、F、G).

结果

图1. 鳞片黑素细胞的抗体染色。A) 从麻醉的miniCoopR-EGFP斑马鱼上拔取鳞片。B) 含有色素化黑素细胞的未漂白鳞片，以及C) 来自miniCoopR-EGFP斑马鱼的漂白鳞片。比例尺 = 100 μM。未漂白鳞片经D) Mitfa抗体和E) DAPI染色。漂白鳞片经F) Mitfa抗体和G) DAPI染色。比例尺 = 40 μM。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gateway 重组试剂	Invitrogen
miniCoopR
Mitfa 抗体
FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体	Invitrogen
Vectashield	Vector Labs	H-1000
casper 斑马鱼
701N 10 μl 注射器	Hamilton/Fisher	14-824
FBS	Invitrogen	26140079