皮下移植实验：一种将黑色素瘤细胞从供体移植到受体斑马鱼模型的方法

摘要

来源：Iyengar, S. 等。利用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因。J. Vis. Exp. (2012)

本视频介绍了将黑色素瘤荷瘤供体斑马鱼模型中的肿瘤细胞移植到免疫缺陷型受体Casper斑马鱼的方法。该方法有助于观察肿瘤细胞在受体鱼体内的植入和增殖过程。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 移植实验

1. 在移植前一日，对2-3月龄的Casper受体鱼进行25 Gy伽马射线辐照处理。处理后将鱼置于养鱼用水中恢复。
2. 根据机构指南实施荷瘤鱼的安乐死。具体操作：将鱼放入含有0.6 mg/mL三卡因的培养皿中，直至鳃部运动停止。
3. 切除肿瘤组织并置于含约5 mL过滤除菌的0.9x PBS（含5% FBS）的培养皿中。在溶液中用刀片将肿瘤组织切碎。
4. 室温下操作，使用P1000移液器反复吹打以获得单细胞悬液。用过滤除菌的0.9x PBS（含5% FBS）将体积补至25 mL。
5. 通过40 μM细胞滤网过滤。
6. 在Eppendorf 5810R台式离心机中以1,500 rpm（453 rcf）离心10分钟。
7. 弃去上清液，并将细胞重悬至大致所需浓度（假设100 mm³肿瘤约为10⁷个细胞）。
8. 使用血细胞计数板精确计算细胞数量，并稀释细胞悬液，使最终注射体积约为5 μL。例如，若需注射50,000个细胞，则应将细胞悬液稀释至终浓度为10,000个细胞/μL。每隔几分钟轻弹细胞悬液管，防止细胞聚集。
9. 用100%乙醇和0.9x PBS将26s规格（斜面尖端）701N 10 μL Hamilton注射器冲洗2-3次。吸取5 μL细胞悬液至注射器中。
10. 用0.17 mg/mL三卡因麻醉经辐照的受体鱼。将鱼侧卧于湿润的Kimwipe纸巾上（图1A）。
11. 一手固定鱼体，另一手持针头，针尖斜面朝上，以约45°角插入鱼体侧腹部位，位置位于后脑边界与背鳍前缘之间约中点处，进针至腹腔上方。轻柔推动推杆（图1B）。
12. 将鱼放回新鲜养鱼用水中使其恢复，并每日观察肿瘤移植情况（图1C）。若移植成功，可进一步观察肿瘤持续生长及疾病进展。

结果

图1. 黑色素瘤细胞移植。 A) 未注射的Casper斑马鱼。比例尺 = 500 μM。 B) 经辐照的Casper受体在皮下移植部位（箭头所示）刚完成50,000个黑色素瘤细胞注射后的图像。比例尺 = 200 μM。 C) 经辐照的Casper受体在注射50,000个黑色素瘤细胞两周后显示肿瘤成功植入（箭头所示）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gateway 重组试剂	Invitrogen
miniCoopR
Casper 斑马鱼
701N 10 μl 注射器	Hamilton/Fisher	14-824
40 μM 滤器	BD Falcon/Fisher	352340
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	26140079