肿瘤细胞侵袭实验：一种基于三维体外天然基质的上皮-间质细胞相互作用评估方法

摘要

来源：Ng, Y. Z. 等。 肿瘤间质微环境的组织工程构建及其在癌细胞侵袭研究中的应用。J. Vis. Exp. (2014)

本视频介绍了利用天然基质研究肿瘤细胞侵袭的技术。该检测方法能够在三维环境中评估上皮-间充质细胞相互作用，而无需使用合成或外源性基质。

方案

1. 培养基与试剂的准备

1. 200倍L-抗坏血酸-2-磷酸盐储备液的制备
   1. 每5 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）溶液中溶解29 mg L-抗坏血酸-2-磷酸盐，并通过0.22 μm膜滤器过滤。分装为0.25 mL无菌等份，于-20 °C保存。
   2. 在需要当天，向每50 mL成纤维细胞培养基（含1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM）中加入0.25 mL 200倍L-抗坏血酸-2-磷酸盐储备液，使L-抗坏血酸-2-磷酸盐终浓度为0.1 mM。
2. 角质形成细胞生长培养基的制备
   1. 原代鳞状细胞癌（SCC）角质形成细胞的分离与培养方法已有先前报道，其中亦描述了角质形成细胞生长培养基的制备方法。
   2. 简要而言，按如下方式配制培养基：
      300 mL DMEM 和 100 mL Ham's F-12，添加10% FBS
      0.4 mg/mL 氢化可的松
      5 mg/mL 胰岛素
      10 ng/mL 表皮生长因子（EGF）
      5 mg/mL 转铁蛋白
      8.4 ng/mL 霍乱毒素
      13 ng/mL 三碘甲状腺原氨酸
      1x 青霉素-链霉素溶液

2. 体外 在添加L-抗坏血酸-2-磷酸的培养基中构建成纤维细胞来源的天然基质

1. 在6孔板中每孔接种200,000个成纤维细胞（20,000个细胞/cm²），使用添加L-抗坏血酸-2-磷酸的成纤维细胞培养基。每2-3天更换一次培养基，每次加入2-5 mL。（注意：可根据不同类型细胞的具体需求调整换液频率和体积。）
2. 培养6周后，肉眼可见形成由细胞嵌入细胞外基质构成的厚层（图1）。为将该层从组织培养板上分离，先用1 mL移液器吸头轻轻刮擦基质边缘，然后将基质边缘向孔中心推动。此细胞与基质层（天然基质）应可轻易从培养板表面脱离，并悬浮于培养基中。在培养基中将天然基质展开，避免其自身折叠。
3. 让天然基质在培养基中漂浮并继续重塑5天，每2-3天更换一次培养基。由于基质内部的张力及固有的重塑能力，基质会显著收缩，转变为更小但更厚的天然基质，可用于后续侵袭实验。

3. 肿瘤SCC角质形成细胞的侵袭实验

1. 用钝头镊子轻轻夹取天然基质，转移至尼龙网上。一旦置于尼龙网上，使用1 mL移液枪头和钝头镊子轻轻铺展基质，使其尽可能平展。
2. 通过在一端涂抹少量无菌凡士林，准备无菌克隆环。
3. 将克隆环放置在天然基质上，凡士林面朝下，以确保天然基质与克隆环之间形成紧密密封。
4. 向克隆环中加入cSCC细胞（100 µl角质形成细胞生长培养基中含有250,000个细胞）。
5. 6小时后，当cSCC细胞已在天然基质上沉降，移除克隆环。
6. 将带有天然基质和cSCC细胞的尼龙网提起，置于弯曲的不锈钢丝网支撑架上，形成气-液界面培养环境。
7. 加入添加了抗坏血酸的角质形成细胞生长培养基，直至培养基液面接触天然基质底部。
8. 每2–3天更换一次培养基，并在cSCC细胞接种后第7天和第14天进行收获。

结果

图1. 成纤维细胞来源的天然基质构建及肿瘤侵袭实验流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-抗坏血酸-2-磷酸 	Sigma	A8960
含L-谷氨酰胺、4,500 mg/L D-葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠的DMEM培养基  	Life Technologies	11995-073
100倍青霉素-链霉素溶液  	Life Technologies	15070
凡士林 	VWR	PROL28908.290
克隆环 	Sigma	Z370789
亲水性尼龙网滤膜圆片，孔径 100 μm，直径 25 μm，每包100片 	Millipore	NY1H02500
弯曲的不锈钢丝网支撑架  	自制		尺寸设计为可放入6孔板中