生物发光成像观察雌性小鼠模型中乳腺肿瘤的进展

摘要

来源：
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>巴西利亚大学生物科学研究所，²巴西利亚大学心理学院基础心理过程系

本视频演示了通过将表达荧光素酶的乳腺腺癌细胞注射到雌性小鼠体内，并监测生物发光信号，以评估原发性和转移性肿瘤随时间进展的体内肿瘤进展追踪方法。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 细胞培养

1. 在含有10%胎牛血清（v:v）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）的DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）中，于37 °C、含5% CO₂的湿化气氛中培养4T1细胞系（ATCC-CRL-2539），该细胞系为小鼠乳腺腺癌细胞。
2. 将Luc2基因转染至原始细胞系中，该基因可表达荧光素酶。这种生物发光酶为持续性产生。

2. 动物模型 - 肿瘤细胞移植

1. 皮下接种表达荧光素酶的生物发光4T1细胞（2 × 10⁵ 每只小鼠接种细胞数）在麻醉（分别按80 mg/kg和10 mg/kg剂量给予氯胺酮和赛拉嗪）条件下注射至雌性Balb/c小鼠左侧背部。
   1. 在实验前，通过腹腔注射指定的麻醉剂（分别为80 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪）对小鼠进行麻醉。
   2. 麻醉诱导5分钟后，剃除小鼠毛发，使用1 mL胰岛素注射器将细胞皮下注射。
      注意共使用5只8周龄小鼠，每只体重约25 g，用于肿瘤诱导及成像。
2. 量化肿瘤生长 体内通过生物发光成像评估荷瘤小鼠，并监测肿瘤生长持续4周。
   1. 在进行生物成像实验时，使用异氟烷（2.5%，用纯化压缩空气稀释）麻醉小鼠。为评估肿瘤进展，利用可检测生物发光信号的设备，每周对小鼠成像一次，持续4周。
      注意： 4T1-luc 萤光素酶生物发光信号被用作评估肿瘤生长和指示肿瘤进展的参数。
3. 成像过程中，将小鼠置于设备指定区域的仰卧位，以采集生物发光图像。
4. 麻醉后，向小鼠腹腔注射 D-荧光素钠（100 µL；15 mg/mL）。
   注意： 由于D-荧光素是荧光素酶的底物，该酶在裂解时可产生光子，而4T1生物发光荧光素酶细胞持续表达这种酶，因此可在活体动物中定量并检测肿瘤。
5. 在每个时间点，对每只动物采集20张生物发光图像，持续20分钟。每张图像代表60秒内发射的生物发光信号。
6. 构建一条生物发光动力学曲线，以表示每分钟发射的信号。为确保每只动物获得最佳结果，记录每个终点时的最大生物发光强度。
7. 进行生物发光图像采集时，使用以下参数：发射滤光片开放，无激发光，binning 为 8，f/stop 为 2，视野类型为 D 型。为生成生长曲线，每周成像动物一次，共持续 4 周。
8. 生物发光成像——原发性肿瘤与肺转移
   1. 为区分原发肿瘤与肺转移灶的信号，使用仪器配套软件定义特定的兴趣区域。
   2. 在注射部位和细胞发生转移的胸腔区域识别生物发光信号。根据这些图像，计算生物发光信号的进展程度，该信号与肿瘤进展高度相关。
   3. 通过数周内采集的图像，为不同肿瘤部位（包括原发性肿瘤和转移性病灶）建立生长动力学曲线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	化学试剂
Dulbecco改良型Eagle培养基	Gibco	A7030	细胞培养基
胎牛血清	Merck	F2442	细胞培养基添加剂
异氟烷	Cristália	NA	麻醉剂
IVIS Lumina	XR	Series III	设备 – 美国
青霉素	Merck	P4333	细胞培养用抗生素
鬼笔环肽-Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A12379	化学试剂
磷酸盐缓冲液	Merck	4437568	化学试剂
链霉素	Merck	P4333	细胞培养用抗生素