皮下双氢睾酮（DHT）处理：多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠模型

摘要

来源：Xue, P., 等. 一种用于研究多囊卵巢综合征的高雄激素小鼠模型. J. Vis. Exp. (2018)。

本文介绍了一种制备和植入双氢睾酮（DHT）缓释颗粒以建立小鼠多囊卵巢综合征（PCOS）模型的方法。示例实验方案展示了用于生殖和代谢研究的小鼠操作流程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 建立类似多囊卵巢综合征的小鼠模型

注意：本研究中使用的小鼠为混合背景（C57/B6、CD1、129Sv），在 24 °C 环境下，按照 14/10 小时明暗循环，自由摄食和饮水 ad libitum 条件下饲养。

1. DHT 小丸制备
   1. 对硅胶管进行高压灭菌以实现消毒。使用剃刀将硅胶管切割成 15 mm 长度。
   2. 使用连接在 3 mL 注射器上的 20 G 钝头针将医用硅胶粘合剂注入管中，以封闭一侧。操作时应先将注射器活塞拉出，然后将粘合剂注入储液腔。重新插入活塞并推动粘合剂，直至其从针头端开始渗出。钝头针可通过使用任何坚固的剪刀剪去 20 G 针头的尖锐端制成。管内硅胶长度应超过 2 mm，以便后续修整。
   3. 室温下干燥过夜；检查封闭端是否存在气泡。无气泡者用于制备 DHT 小丸，其余可用于制备无 DHT 对照小丸。
   4. 在通风橱内制备 DHT 小丸前，需佩戴手套、口罩、护目镜和实验服，以避免皮肤接触 DHT。
   5. 将 DHT 粉末倒入塑料称量舟中，并将已封一端的开放侧管（按步骤 1.1.1 制备）压入 DHT 粉末中。
   6. 可用拉直的大号回形针将 DHT 粉末压实，直至粉末高度达到 4 mm（或所需长度）。使用尺子确认 DHT 长度，然后用硅胶封闭开口端，室温下干燥过夜。
   7. 将每侧封闭端修整至硅胶长度为 2 mm。最终小丸总长度为 8 mm。
   8. 将空硅胶管两端均用硅胶封闭，作为对照（无 DHT）小丸。
   9. 将小丸置于 50 mL 锥形管中，用铝箔包裹（避免光照），室温保存备用。DHT 小丸在储存至少 3 个月内可保持完全活性。
2. DHT 植入与更换
   1. 在植入前，将最多 20 个 DHT 小丸或对照小丸分别浸入含 30 mL 无菌 0.9% 生理盐水的 50 mL 锥形管中，在 37 °C 下平衡 24 小时。
   2. 手术前，使用克洛多克斯（clidox）对操作表面和手套进行消毒，并在工作台面覆盖洁净的塑料背衬吸水纸（手术垫）。所有与动物接触的器械在进入动物设施前均需通过高压灭菌进行去污处理。  器械使用前应使其充分干燥并冷却。
   3. 选用 2 月龄雌性小鼠（每笼 4–5 只）。使用胰岛素注射器经腹腔注射赛拉嗪（3.5 mg/kg 体重） 和氯胺酮（78.8 mg/kg 体重）。麻醉剂配制与剂量计算见 表 1。  
   4. 当小鼠达到充分麻醉状态（表现为趾反射消失和呼吸减慢）后，开始手术准备。
   5. 使用无菌纱布蘸取聚维酮碘对术区皮肤进行消毒，再用 70% 乙醇清洁。 随后再次涂抹聚维酮碘。
   6. 在颈部皮下用剪刀剪开约 5 mm 长的切口。使用 10 G 套管针向头侧方向建立一条长约 15 mm 的皮下隧道。通过套管针将小丸背侧植入。
   7. 随后使用外科粘合剂封闭切口。用镊子手动对合伤口边缘，并以轻柔刷涂方式在对合的伤口边缘涂布一层薄薄的液体粘合剂。构建 3 层薄层粘合剂，确保其在伤口上均匀分布。粘合剂应向对合伤口边缘两侧各延伸约 1 cm。也可使用缝线或外科夹闭合切口。术后将小鼠单独饲养于笼中，并放置加热垫以助恢复。每 4 周更换一次小丸，以维持稳定的雄激素暴露水平。更换时按上述方法取出原小丸，并在同一位置植入新的小丸。

氯胺酮 (100 mg/mL)	赛拉嗪 (100 mg/mL)	生理盐水 (0.9%)
175 μL	15 μL	810 μL
工作液腹腔注射：0.1 mL/20g 体重

表1. 氯胺酮/赛拉嗪混合液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结晶 5α- DHT 粉末	Sigma-Aldrich	A8380-1G
道康宁硅胶管	Fisher Scientific	11-189-15D	内径 0.04 英寸/1 毫米，外径 0.085 英寸/2.15 毫米
医用粘合硅胶	凝血因子 II，InC	A-100
护目镜、实验服、手套和口罩
3 mL注射器	Becton, Dickinson and Company (BD)	30985
连接的针头：20G	BD	305176
尺子：任意长度超过10 cm且带毫米刻度的尺子。
赛拉嗪	Vet one AnnSeA LA, MWI, 博伊西	NDC13985-704-10	100 mg/mL
盐酸氯胺酮	Hospira, Inc	NDC 0409-2051-05	100 mg/mL
外科缝合钉	AutoClip® 系统，Fine Science Tool	12020-00
胰岛素注射器	BD	329461	1/2 CC，低剂量U-100胰岛素注射器
套管针	Innovative Research of America	MP-182
剃刀刀片	Fisher Scientific	12-640
Clidox	Fisher Scientific	NC0089321
手术用垫单	Fisher Scientific	50587953	Andwin Scientific 56616018
聚维酮碘消毒液	Walgreens
3M Vetbond（正丁基氰基丙烯酸酯）	3M 科学，应用于生活