系统性匹罗卡品治疗：颞叶癫痫小鼠模型

摘要

来源：Kim, J. E. 和 Cho, K. O. 小鼠中使用遥测系统的匹罗卡品颞叶癫痫模型及脑电图监测. J. Vis. Exp. (2018).

本视频介绍了通过全身给予匹鲁卡品在小鼠中诱导癫痫持续状态（SE）以模拟颞叶癫痫的实验操作流程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. SE 诱导

1. 购买8周龄的雄性C57BL/6NHsd小鼠，并称量每只小鼠的体重。然后使用记号笔标记所有小鼠的尾巴，以便在诱发癫痫持续状态（SE）期间易于识别。
2. 根据小鼠体重计算溴甲基东莨菪碱（东莨菪碱；2 mg/kg）、硫酸特布他林（特布他林；2 mg/kg）和盐酸匹罗卡品（匹罗卡品；280 mg/kg）的用量，并加入生理盐水（0.9% NaCl，10 mL/kg）配制成溶液。
   注意： 例如，若小鼠体重为25 g，则应用以下剂量：东莨菪碱和特布他林：2 mg/kg × (25 g/1,000 g) = 0.05 mg，生理盐水：10 mL/kg × (25 g/1,000 g) = 0.25 mL；匹罗卡品：280 mg/kg × (25 g/1,000 g) = 7 mg，生理盐水：10 mL/kg × (25 g/1,000 g) = 0.25 mL。
3. 将东莨菪碱和特布他林混合液装入带有30 G针头的1 mL注射器中。对每只小鼠进行腹腔注射后，将小鼠放回笼中。在给予东莨菪碱和特布他林30分钟后，向每只小鼠腹腔注射匹罗卡品溶液（i.p.；1 mL注射器；30 G针头）。匹罗卡品注射后立即把小鼠放入孵育箱（28–30°C）中进行观察。
4. 仔细监测小鼠行为直至癫痫持续状态（SE）被诱发。若观察到符合Racine分级3级或以上水平的边缘运动性癫痫发作，则记录时间并继续监测以判断癫痫发作是否更加频繁。一旦出现持续超过2分钟的运动性癫痫发作，即将小鼠转移至室温下的新笼中，并持续监测3小时，以确认其惊厥性发作是否持续以及SE是否成功诱发。对于在匹罗卡品注射约2小时后仍未进入SE的小鼠实施安乐死。
   注意： Racine分级：1级，口部及面部运动；2级，点头；3级，前肢阵挛；4级，直立伴前肢阵挛；5级，直立跌倒伴前肢阵挛。若在SE诱发后未立即将小鼠转移至室温笼中，小鼠可能因高热而死亡。
5. 在SE发作3小时后，通过腹腔注射地西泮溶液（i.p.；10 mg/kg；1 mL注射器；30 G针头）终止行为学急性癫痫发作。地西泮溶液的配制方法为：将5 mg/mL的地西泮用10%聚氧乙烯35氢化蓖麻油稀释，并加入生理盐水（i.p.；10 mL/kg；1 mL注射器；30 G针头）调整体积。 
   注意： 10%聚氧乙烯35氢化蓖麻油溶液：1 mL聚氧乙烯35氢化蓖麻油溶液 + 9 mL生理盐水。该溶液于室温保存。例如，若小鼠体重为25 g，则注射250 µL地西泮溶液：50 µL 5 mg/mL地西泮 + 200 µL 10%聚氧乙烯35氢化蓖麻油溶液 = 250 µL 1 mg/mL地西泮。
6. 对于假手术组（sham）小鼠，进行腹腔注射东莨菪碱溴甲基化物与硫酸特布他林混合液（i.p.；两者均为2 mg/kg，10 mL/kg；1 mL注射器；30 G针头）。30分钟后，进行生理盐水腹腔注射（i.p.；10 mL/kg；1 mL注射器；30 G针头）。
   注意： 若小鼠体重为25 g，则用250 µL生理盐水代替匹罗卡品注射。
7. 地西泮腹腔注射后（i.p.；1 mL注射器；30 G针头），为每只小鼠腹腔注射1 mL 5%葡萄糖溶液（i.p.；1 mL注射器；26 G针头）。
   注意： 1 mL 5%葡萄糖注射液可提供能量来源和水分补充，有助于提高存活率。
8. 在孵育箱（28–30 °C）中进行术后护理期间，及时清除过多的分泌物，如唾液、泪液和粪便。
9. 在SE诱发后的第1天称量小鼠体重，并将其继续留在孵育箱（28–30 °C）中额外饲养一天。在SE诱发后的第2天再次称重，并将小鼠放回原笼。提供湿润饲料以促进其恢复。
   注意： 本实验中，C57BL/6NHsd小鼠在SE终止后的平均死亡率为8.57%（共测试35只小鼠，死亡3只）。
10. 持续每日测量动物体重直至匹罗卡品注射后第7天，若发现体重未增加，则给予5%葡萄糖腹腔注射（i.p.；1 mL注射器；26 G针头）。当小鼠在匹罗卡品注射后第2天开始恢复体重增长且能无障碍摄食湿润饲料时，停止体重监测。
    注意： 若某只小鼠在SE后7天内体重仍未增加，则将其排除实验并采用二氧化碳安乐死。根据小鼠品系背景不同，偶有死亡发生；但在C57BL/6NHsd小鼠中，此类实验的死亡率低于1%。若小鼠在SE诱发后存活超过7天，则在潜伏期内极少发生死亡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
硝酸甲基东莨菪碱	Sigma	S2250	配制10倍储存液
硫酸特布他林盐	Sigma	T2528	配制10倍储存液
盐酸毛果芸香碱	Sigma	P6503
地西泮	SAMJIN
蓖麻油（Kolliphor EL）	Sigma	C5135	聚氧乙烯35氢化蓖麻油
生理盐水	Daihan pharm. Co.
5%葡萄糖	Daihan pharm. Co.
1 mL注射器	Sung shim medial Co.  Ltd.
26号针头	Sung shim medial Co.  Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30号针头	Sung shim medial Co.  Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")