从肿瘤制备类器官：一种三维体外肿瘤模型

摘要

来源：Wadosky, K. M. 等人。利用前列腺癌转基因小鼠模型生成肿瘤类器官。J. Vis. Exp. (2019)。

由肿瘤衍生的类器官是一种三维细胞培养模型，能够维持肿瘤的病理特征和器官特异性的细胞谱系。在本示例方案中，我们将看到科研人员利用基因工程小鼠模型中的前列腺肿瘤组织生成类器官。

方案

本文所述动物实验程序已获得纽约州布法罗市罗斯韦尔帕克综合癌症中心实验动物资源部机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

注意：用于解剖分离前列腺或前列腺肿瘤以建立类器官的雄性小鼠，应至少达到性成熟年龄——约为8至10周龄。不同研究中所使用小鼠的具体年龄可能有所不同。在选择小鼠年龄时需考虑的因素包括：前列腺细胞群体的年龄依赖性变化、特定启动子驱动的Cre转基因表达的年龄依赖性，以及特定基因工程小鼠模型（GEMM）中前列腺肿瘤进展的速度。

注意： 图1 展示了肿瘤类器官生成步骤的示意图。

1. 准备

1. 根据 Drost 的方法制备小鼠前列腺类器官培养基 等 使用条件培养基替代Noggin和R-Spondin的重组蛋白，并将Noggin和R-Spondin条件培养基的终浓度均调整为1%（v/v），而非10%。
   注意： 稳定转染 HA-小鼠 Noggin-Fc 或 HA-小鼠 Rspo1-Fc 的 HEK293 细胞分别用于制备 Noggin 或 R-Spondin 条件培养基。这些细胞系由斯坦福大学 Calvin Kuo 实验室惠赠。
2. 在15 mL离心管中配制消化液：将20 mg/mL的胶原酶II用Advanced DMEM/F12(+++)培养基稀释至终浓度为5 mg/mL。向胶原酶II溶液中加入Y-27632 ROCK抑制剂，使其终浓度为10 µM。
   注意： 消化缓冲液与组织的比例为1 mL:50 mg，我们依据Drost的方法采用该比例 等

2. 肿瘤组织的剪碎与消化

1. 在细胞培养超净台中，将前列腺肿瘤组织置于无菌的 10 cm 培养皿中，解剖并弃去坏死组织。
2. 用无菌弯头镊子夹住组织块，使用解剖剪将其剪切成约 1 mm³ 的小块。
3. 用镊子的弯曲侧将剪碎的肿瘤组织块转移至含有消化缓冲液的 15 mL 离心管中。在 37 °C 条件下振荡消化 1.5 至 2 小时，每 20 分钟检查一次消化进度。
   注意： 此时，从 -20 °C 保存处取出至少 2 mL 基质胶，并置于冰上融化。1 mL 分装的基质胶约需 3 小时才能完全融化。
4. 组织消化完成后，在 4 °C 条件下以 175 × g 离心 5 分钟，形成细胞沉淀。
5. 吸除上清液，轻弹离心管以松散细胞沉淀，然后将细胞沉淀重悬于 1 mL 预热的含 10 µM Y-27632 Rock 抑制剂的胰蛋白酶溶液中。将离心管置于 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。
6. 孵育后，使用标准 P1000 吸头上下吹打 5 次。再次将离心管放回 37 °C 水浴中孵育 5 分钟，并重复步骤 2.6。
   注意： 此时，将一个无菌的 6 孔细胞培养板放入 55 °C 培养箱中预热。

3. 细胞计数及在基质中的重悬

1. 用 9 mL 冷的 AdDMEM/F12(+++) 洗涤细胞，然后以 175 × g 离心管子 g 4 °C下离心5分钟。
2. 离心后，弃去上清液，轻弹管壁以松动沉淀，再加入 10 mL 冷的 AdDMEM/F12(+++) 重悬细胞并洗涤。将管子在 175 x g 4 °C下离心5分钟。
3. 离心后，弃去上清液，轻弹管壁以松动沉淀，将细胞重悬于1 mL AdDMEM/F12(+++)中，按照标准操作使用血细胞计数板对细胞进行计数。
4. 一个6孔板的单孔中可容纳7到8个类器官穹顶，当类器官接种于基质中时 通过 逐滴加入的方式。约 200 μL 基质可形成 7–8 个凝胶滴。根据后续实验所需类器官的孔数，计算所需的基质体积。然后，计算含有细胞的溶液所需体积，以达到终浓度为 1.0 × 10⁶ 细胞/毫升基质
5. 计数细胞后，以175 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。弃上清，轻弹管壁以松散沉淀，然后将细胞重悬于步骤3.4中计算出体积的基质中。
   注意： 基质在4 °C时保持液态；基质储存管及基质-细胞溶液须始终置于冰上。

4. 铺板基质穹顶及培养基应用

1. 使用P200移液器混合基质-细胞溶液，以均匀分散细胞，同时避免产生气泡。将6孔培养皿从55 °C培养箱中取出。
2. 小心吸取200 μL基质-细胞溶液，迅速滴加到孔中形成穹顶状结构。
3. 重复步骤4.2，直至基质-细胞溶液用完。室温下静置2分钟，使穹顶结构凝固。
4. 将6孔培养皿倒置，放入37 °C培养箱中继续凝固20分钟。
5. 培养结束后，向每孔加入2 mL小鼠前列腺类器官培养基。向每孔加入合成雄激素R1881，使其终浓度为1 nM，并加入Y-27632 Rock抑制剂，使其终浓度为10 μM。轻轻混匀后，将培养板置于37 °C培养箱中进行培养。
   注意：类器官培养基仅需在类器官生成后的第一周内添加10 µM Y-27632 Rock抑制剂。

结果

图1：生成前列腺肿瘤类器官的实验流程图。 解剖前列腺肿瘤后，将组织切成约1 mm大小的组织块。用胶原酶消化组织块，收集细胞后，再用胰蛋白酶消化以获得单细胞悬液。计数细胞后，重悬于适量基质胶中，使细胞浓度达到1.0 × 10⁶ 个细胞/mL。采用逐滴加入法将细胞悬液滴加至培养皿中形成穹顶状结构。请点击此处查看该图的高清版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶+2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
分析天平	Mettler Toledo	30216623
B27 (50倍浓缩)	Gibco	17504044
胶原酶II	Gibco	17101015
EHS肉瘤基质，Pathclear批号#19814A10	由Trevigen生产	从弗雷德里克国家实验室的美国国家癌症研究所申领	持有美国国家癌症研究所资助项目的人员可申请该基质
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
人重组表皮生长因子（EGF）	PeproTech	AF-100-15
L-谷氨酰胺 (200 mM)	Sigma	25-005
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A9165
青霉素-链霉素	Sigma	P4333
精密天平	Mettler Toledo	30216561
单刃碳素剃须刀片	Fisherbrand	12-640
Y-276632 (ROCK抑制剂)	APExBIO	A3008