从肿瘤制备类器官:3D 体外肿瘤模型

此处描述的动物程序是在纽约州布法罗罗斯威尔公园综合癌症中心实验动物资源部的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准下进行的。

注意:要解剖的雄性小鼠以分离前列腺或前列腺肿瘤以产生类器官，至少应达到性成熟的年龄——大约 8-10 周大。小鼠的具体年龄可能因研究而异。选择年龄时要考虑的一些因素包括前列腺细胞群的年龄依赖性变化、特定启动子驱动的 Cre 转基因的年龄依赖性表达以及特定 GEMM 中前列腺肿瘤的进展速度。

注:图 1 显示了肿瘤类器官生成过程的图形描述。

1. 准备工作

1. 根据 Drost 等人制备小鼠前列腺类器官培养基，并进行以下改动。对于 Noggin 和 R-Spondin，使用条件培养基代替重组蛋白，对于 Noggin 和 R-Spondin 条件><培养基，使用终浓度为 1% （v/v） 而不是 10%。 注意:用 HA 小鼠 Noggin-Fc 或 HA 小鼠 Rspo1-Fc 稳定转染的 HEK293 细胞分别用于制备 Noggin 或 R-Spondin 条件培养基。这些细胞系是斯坦福大学 Calvin Kuo 实验室的礼物。
2. 用高级 DMEM/F12（+++） 培养基稀释 20 mg/mL 胶原酶 II，使其最终浓度为 5 mg/mL，在 15 mL 试管中制备消化溶液。将 Y-27632 Rock 抑制剂添加到终浓度为 10 μM.
   的胶原酶 II 溶液中 注意:消化缓冲液与组织的比例为 1 mL 至 50 mg，我们根据 Drost 等人使用。

2. 肿瘤组织的切碎和消化

1. 在细胞培养罩中，将前列腺肿瘤组织置于无菌的 10 cm 培养皿中，解剖并丢弃坏死组织。
2. 用无菌弯曲的镊子夹住组织块并用解剖剪刀切割，将剩余的前列腺肿瘤组织切成 1 mm³ 的立方体。
3. 用镊子的弯曲侧舀起切碎的肿瘤块，将它们放入装有消化缓冲液的 15 mL 管中。在 37 °C 下振荡消化肿瘤组织 1.5 至 2 小时。每 20 分钟检查一次消化进度
   注意:此时，从 -20 °C 储存中取出至少 2 mL 基质并在冰上解冻。1 mL 等分试样的基质大约需要 3 小时才能解冻。
4. 组织消化后，将试管在 4 °C 下以 175 x g 离心 5 分钟以形成细胞沉淀。
5. 取出上清液，轻弹试管以松开细胞沉淀，然后将细胞沉淀重悬于 1 mL 补充有 10 μM Y-27632 Rock 抑制剂的预热胰蛋白酶中。将试管置于 37 °C 水浴中 5 分钟。
6. 孵育后，用标准 P1000 吸头上下移液 5 次。将试管放回 37 °C 水浴中再 5 分钟，然后重复步骤 2.6.
   注意:此时，在程序中，将无菌 6 孔细胞培养皿放入 55 °C 培养箱中加热。

3. 在基质中计数和重悬

1. 加入 9 mL 冷 AdDMEM/F12（+++） 洗涤细胞，并在 4 °C 下以 175 x g 离心试管 5 分钟。
2. 离心后，取出上清液，轻弹试管以松开沉淀，然后加入 10 mL 冷 AdDMEM/F12（+++） 再次洗涤细胞。将试管在 4 °C 下以 175 x g 离心 5 分钟。
3. 离心后，取出上清液，轻弹试管以松开沉淀，将细胞重悬于 1 mL AdDMEM/F12（+++） 中，并根据标准程序使用血细胞计数器计数细胞数。
4. 当类器官通过逐滴方式接种在基质中时，7 到 8 个圆顶适合 6 孔培养皿的一个孔中。大约 200 μL 基质将产生 7-8 个圆顶。确定未来实验目的需要多少个类器官孔，并计算所需的基质体积。然后，计算基质的最终浓度为 1.0 x 10⁶ 个细胞/mL 所需的含细胞溶液的体积。
5. 计数细胞后，在 4 °C 下以 175 x g 离心 5 分钟。取出上清液，轻弹试管以松开沉淀，并在步骤 3.4.
   中计算的基质体积中重悬细胞 注意:基质仅在 4 °C 下保持液态;始终将 Matrix 储备管和 Matrix-Cell 溶液放在冰上。

4. 电镀矩阵圆顶与介质应用

1. 将基质-细胞溶液与 P200 移液管混合，以均匀分布细胞，而不会引入气泡。从 55 °C 培养箱中取出 6 孔培养皿。
2. 小心吸取 200 μL 基质细胞溶液，然后将溶液快速滴入孔中以形成圆顶。
3. 重复步骤 4.2。直到基质细胞溶液的体积用完。让圆顶在室温下凝固 2 分钟。
4. 将 6 孔培养皿倒置，将培养皿放入 37 °C 培养箱中继续凝固 20 分钟。
5. 孵育后，向每个孔中加入 2 mL 小鼠前列腺类器官培养基。向每个孔中加入合成雄激素 R1881，终浓度为 1 nM，Y-27632 岩石抑制剂，终浓度为 10 μM。小心混合，并将板置于 37 °C 培养箱中进行培养><。 注意:类器官培养基在类器官生成后仅需补充 10 μM Y-27632 Rock 抑制剂 1 周。

图 1:生成前列腺肿瘤类器官的方案流程图。解剖前列腺肿瘤后，将组织切成 1 毫米的小块。在胶原酶中消化肿瘤碎片，收集细胞，并在胰蛋白酶中消化以获得单细胞悬液。细胞计数后，重悬于 1.0 x 106 个细胞/mL 细胞浓度所需的基质体积中。使用逐滴方法在培养皿中板圆顶。请点击这里查看此图的较大版本。