功能化纳米颗粒靶向卵巢癌：一种促进叶酸偶联纳米颗粒造影剂被卵巢癌细胞摄取的技术

摘要

来源：Lusk, J. F. 等. 利用光声流式细胞术检测卵巢癌. J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了一种促进叶酸修饰的硫化铜纳米颗粒（CuS NPs）内化的技术。经叶酸功能化的CuS NPs能够靶向多种卵巢癌细胞中高表达的叶酸受体。

方案

1. 纳米颗粒的合成与功能化

注意：所有合成操作均应在通风良好的化学通风橱中进行。

1. 合成前，将约 300 mL 去离子水（DI 水）通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤。
2. 用洗涤剂溶液清洗一个 250 mL 玻璃圆底烧瓶，并用去离子水冲洗。将 0.0134 g CuCl₂ 加入 100 mL 去离子水中，配制成 1 mM 溶液。
3. 将 0.015 g 叶酸（FA）加入 CuCl₂ 溶液中，使用磁力搅拌子搅拌约 5 分钟。
4. 用 200 µL 移液器在约 10 秒内将 Na₂S·9H₂O（0.024 g 溶于 100 µL 去离子水）加入反应混合物中。
   注意：加入 Na₂S·9H₂O 后，溶液颜色将由浅黄色变为深棕色。
5. 密封反应体系，放入设定为 90 °C 的油浴中，并继续用磁力搅拌子搅拌。约 15 分钟后，或当油浴温度达到 85−90 °C 时，继续反应 1 小时。反应混合物应逐渐变为深绿色。
   注意：加热反应混合物时，务必对系统进行排气，以避免压力积聚。
6. 将反应容器从油浴中取出，在室温下短暂冷却约 10 至 15 分钟，然后转移至冰浴中。
7. 当反应混合物冷却至 20 °C 以下时，使用 1 M NaOH 调节 pH 至 10，使剩余的叶酸完全溶解。
8. 使用 30 kDa 离心柱纯化 FA-CuS 反应混合物。将溶液以 15 mL 为一批次加入离心柱中，在 3,082 x g 条件下离心 15 分钟。
9. 当全部反应混合物浓缩完成后，合并浓缩组分，并在 30 kDa 离心柱中用 15 mL pH 10 的 NaOH 溶液洗涤 4 次。
10. 进行质量测定时，取三分之一溶液（约 66 µL），分装至三个玻璃小瓶中，在真空度约为 27 mmHg 的条件下，于 40 °C 真空烘箱中干燥过夜。
11. 将剩余三分之二的浓缩溶液溶于 250 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 °C 保存以备后续使用。
12. 在使用 FA-CuS 纳米颗粒（NPs）前，将其置于水浴超声仪中，高功率超声处理 30 分钟。

2. 卵巢癌细胞对FA-CuS纳米颗粒的摄取

1. 在与FA-CuS NPs孵育之前，先将SKOV-3细胞接种于T75培养瓶中，加入8−15 mL不含叶酸的RPMI-1640完全培养基（含10% FBS和1%青霉素/链霉素），培养至少24 h。
2. 将细胞以0.1 × 10⁶ 细胞/mL的密度，接种于24孔板中，每孔加入0.5 mL不含叶酸的RPMI-1640完全培养基。
3. 次日，将细胞与400 µg/mL FA-CuS NPs在0.5 mL不含叶酸的RPMI-1640完全培养基中共同孵育2 h。
4. 孵育结束后，用0.5 mL含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入至少1 mL不含叶酸的RPMI-1640完全培养基以中和胰蛋白酶，然后在123 × g 离心6 min。
5. 弃去上清液，将细胞重悬于2 mL PBS中，再次在123 × g 离心6 min。重复此洗涤步骤2次，以去除未结合的NPs。
6. 将细胞重悬于含2% Tween溶液的1−2 mL PBS中。
7. 使用血细胞计数板和台盼蓝对细胞进行计数；若细胞浓度过高，需进一步稀释。将细胞用含2% Tween的PBS稀释至选定的检测浓度。
8. 细胞现已准备好用于PAFC系统的分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含EDTA的0.025%胰蛋白酶	Corning	25-053-Cl
Amicon Ultra-15离心过滤器	Millipore	UFC903024
Amicon Ultra-4离心过滤器	Millipore	UFC803024
Bright-Line血细胞计数板	Hausser Scientific	1492
氯化铜(II)	ACROS ORGANICS	206532500
CPX系列数字超声波清洗浴	Fisherbrand	Model CPX3800
Norm-Ject 10 mL注射器	HENKE SASS WOLF	4100-X00V0
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
叶酸	Sigma-Aldrich	F7876-10G
PBS	Alfa Aesar	J62036
青霉素-链霉素	GIBCO	15140-122
不含叶酸的RPMI 1640培养基(1x)	Gibco	27016-021
SKOV-3细胞	ATCC	HTB-77
氢氧化钠颗粒	BDH	BDH9292-500G
九水合硫化钠	Sigma-Aldrich	431648-50G
0.4%台盼蓝溶液	Amresco	K940-100ML
0.2 µm无菌注射器滤器	VWR	28145-477
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1.8KG	用于清洗玻璃器皿的洗涤剂。
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML