线粒体分离：一种从人卵巢癌组织样本中分离线粒体的技术

摘要

来源：Zhan, X. 等 卵巢癌组织和对照卵巢组织线粒体的制备及其在定量蛋白质组学分析中的应用。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了使用差速离心结合密度梯度离心法从人卵巢癌组织中分离线粒体的实验步骤。所分离的线粒体可用于人卵巢癌线粒体蛋白质组的蛋白质组学分析。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 人卵巢癌组织线粒体的制备

本方案使用了包括卵巢癌组织（n = 7）在内的卵巢组织样本。

1. 通过混合210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、100 mM氯化钾（KCl）、50 mM Tris-HCl、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1 mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂、2 mM正钒酸钠（V）和0.2%牛血清白蛋白（BSA），配制250 mL线粒体分离缓冲液，调节pH至7.4。
2. 将约1.5 g卵巢癌组织置于洁净的玻璃培养皿中。
3. 加入2 mL预冷的线粒体分离缓冲液，轻轻冲洗组织表面，重复3次以去除血液。
4. 使用洁净的眼科剪将组织彻底剪碎成约1 mm³大小的组织块，并将剪碎的组织转移至50 mL离心管中。
5. 加入含0.2 mg/mL nagarse的线粒体分离缓冲液13.5 mL，使用电动匀浆器进行匀浆处理（设置档位2，每次10秒，共6次，间隔10秒），在4 °C条件下处理2分钟。
6. 向组织匀浆液中再加入3 mL线粒体分离缓冲液，通过移液操作充分混匀。
7. 将制备好的组织匀浆液在1,300 × g 条件下离心10分钟（4 °C），弃去粗核组分（即沉淀），保留上清液。
8. 将上清液再次离心（10,000 × g，10分钟，4 °C），弃去微粒体组分（即上清液），保留沉淀。
9. 加入2 mL线粒体分离缓冲液，通过轻柔移液充分重悬沉淀。
10. 将重悬的沉淀物在7,000 × g 条件下离心10分钟（4 °C），弃去上清液，保留粗线粒体（即沉淀）。
11. 加入12 mL 25%密度梯度介质（即Nycodenz），重悬提取得到的粗线粒体。
12. 自下而上依次向离心管中加入5 mL 34%、8 mL 30%、12 mL 25%（含步骤1.11中粗线粒体）、8 mL 23%和3 mL 20%的密度梯度介质，形成不连续密度梯度，随后在52,000 × g 条件下离心90分钟（4 °C）。
13. 使用长而钝的注射器从25%与30%密度梯度介质之间的界面处收集纯化的线粒体，并转移至洁净离心管中。
14. 向收集的线粒体中加入线粒体分离缓冲液，稀释至原体积的三倍，随后在15,000 × g 条件下离心20分钟（4 °C），弃去上清液。
15. 加入2 mL线粒体分离缓冲液重悬沉淀，再次在15,000 × g 条件下离心20分钟（4 °C），弃去上清液，保留沉淀。
16. 收集最终沉淀（即纯化的线粒体），于-20 °C保存。
    注意：将来自卵巢癌组织的所有纯化线粒体合并，作为定量蛋白质组学分析的线粒体样品。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	798681-100G	无水，自由流动，Redi-Dri，≥98%
DTT	Sigma	10197777001	1,4-二硫苏糖醇
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）	Sigma	E0396-10G	BioXtra，≥97.0%
匀浆器	SilentShake	HYQ-3110
低温超速离心机	Eppendorf	5424R
离心机	XiangYi	TDZ4--WS
甘露醇	Macklin	M813424-100G	甘露醇是一种由果糖氢化生成的多元醇（多元醇），可用作甜味剂、保湿剂和填充剂。它具有低吸湿性且在油中溶解性差。
苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂	Solarbio	P0100-1ML	PMSF 是一种蛋白酶抑制剂，可与丝氨酸残基反应，从而抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和木瓜蛋白酶。
氯化钾	Macklin	P816354-25G	氯化钾（KCl），又称氯化钾盐或钾石盐，是一种无色结晶固体，具有咸味，熔点为 776°C（1420 °F）。它可溶于水，但不溶于酒精。氯化钾广泛用于肥料、制药、摄影以及作为食盐替代品。