建立转移性子宫内膜癌模型：一种在兔模型中诱导子宫内膜癌伴淋巴结转移的技术

摘要

来源：Lauren Philp 等。利用体内传代培养的 VX2 细胞构建具有腹膜后淋巴结病变的原位子宫内膜癌模型。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了通过将高转移性的VX2细胞悬液注射到兔结扎的子宫角中，建立子宫内膜癌兔模型的方法。该方法可成功诱导原发性子宫内膜癌并伴有腹膜后淋巴结转移。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 体外VX2细胞系的建立

1. 从兔股四头肌中收获 VX2 肿瘤并在小鼠 flank 部位进行移植生长。
   1. 解冻冷冻的 VX2 肿瘤组织块（1 cm × 1 cm），在培养皿中使用手术刀片将其切碎，并通过加入少量 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）逐步冲洗，使所有细胞通过 70 µm 滤网，最终体积为 1 mL。
   2. 计数细胞，并用 0.9% 磷酸盐缓冲盐水溶液稀释至浓度为 1 × 10⁷/mL，置于冰上无菌管中。
      注意：肿瘤组织块由实验室合作者提供，来源于既往在兔股四头肌中传代培养的 VX2 肿瘤。
   3. 使用 2–5% 吸入式异氟烷麻醉雌性新西兰白兔（体重 2.5–3.5 kg），去除注射部位的毛发，并用聚维酮碘溶液清洁注射区域。将 500 µL 制备好的 VX2 细胞悬液（5 × 10⁶ 个细胞/mL）注射至兔股四头肌内。从第 10 天开始临床监测肿瘤生长情况。
   4. 当肿瘤直径达到 1–1.5 cm（使用游标卡尺体外测量）时，采用兽医批准的方法处死兔子。通过检测心率和呼吸频率确认动物死亡。用聚维酮碘溶液清洁局部区域后，使用无菌器械切除肿瘤。
   5. 在生物安全柜中使用无菌器械，将肿瘤组织置于 10 cm 组织培养皿上，用手术刀片切成约 0.2 cm 的小块。按照步骤 1.1.1 所述方法，使用 1 mL HBSS 将肿瘤碎片通过 70 µm 细胞筛网过滤。计数细胞后，用 0.9% 生理盐水稀释，获得含 7.5 × 10⁵ 个细胞的 200 µL 溶液。
   6. 使用 4% 异氟烷（流速 1 L/min）麻醉雄性 NOD SCID gamma 小鼠（体重 25 g），并以 2% 异氟烷维持麻醉。待小鼠麻醉后，使用 27 号针头将步骤 1.1.5 中的 200 µL 溶液注射至小鼠 flank 部皮下组织。
2. VX2 细胞的体外收获与传代
   1. 每周两次进行临床观察异种移植瘤的生长情况，直至肿瘤直径达到 1 cm（使用游标卡尺测量）。
   2. 将小鼠置于 CO₂ 室内或在使用 4% 异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死。在生物安全柜中无菌条件下切除肿瘤。
   3. 在含有 3 mL DMEM/Ham's F12 + 10% 胎牛血清（FBS）培养基的 6 cm 组织培养皿中，使用手术刀将肿瘤切成 1–2 mm 大小的组织块。
   4. 将肿瘤碎片置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中静置培养两天，直至细胞从组织块边缘开始迁移生长。此后每日通过光学显微镜观察细胞融合度。当细胞融合度达到 70% 时，加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶消化液，放回 37 °C 培养箱孵育 5 分钟进行胰酶消化。
   5. 加入 6 mL DMEM/Ham's F12 + 10% FBS 培养基中和胰蛋白酶，收集细胞并在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 3.5 mL 新鲜 DMEM/Ham's F12 + 10% FBS 培养基中。将每块 6 cm I 型胶原包被培养板接种 1.6 × 10⁶ 个细胞，使初始接种密度约为 50%。
      ​注意：50% 细胞密度指细胞贴壁后占据培养板表面积的 50%。
   6. 早期传代：重复上述操作（胰酶消化、接种）直至完成 5 次传代，随后使用定量 PCR 检测细胞系纯度，通过特异性引物区分兔基因组 DNA 与小鼠基因组 DNA（参见步骤 1.3.1–1.3.4）。
      注意：经过 8 次传代后，细胞可在未包被胶原的常规贴壁组织培养板上继续培养。
   7. 进行传代、胰酶消化后，将细胞以每管 2 × 10⁶ 个的密度分装至含 DMEM/Ham's F12 + 30% FBS + 10% DMSO 的冻存液中，冻存于液氮中，待后续实验使用。
3. 确认存活细胞的 VX2 来源：
   1. 使用纯化的鼠和兔基因组 DNA（步骤 1.3.2 和步骤 1.3.3）建立标准曲线。采用针对 LINE-1 逆转座子元件第二开放阅读框中物种特异性序列的引物。
      注意：CRPV E6 的引物序列为：5'-GATCCTGGACCCAACCAGTG 和 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT。所用 LINE-1 逆转座子元件的引物序列如下：兔 LINE-1 引物序列为 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC 和 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT；鼠 LINE-1 引物序列为 5'-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG 和 5'-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG。
   2. 为建立 CRPV E6 的标准曲线，使用商品化试剂盒按照制造商说明书纯化 VX2 肿瘤细胞裂解液（步骤 1.1.1），并通过商品化检测方法定量 DNA。使用低 EDTA-TE 缓冲液将 DNA 进行 6 次连续稀释，浓度范围从 225 pg/µL 至 0.925 pg/µL。为建立小鼠基因组 DNA 标准曲线，将 100 µg 商品化小鼠基因组 DNA 溶于低 EDTA-TE 缓冲液，进行 5 次稀释，浓度范围从 125 pg/µL 降至 0.0125 pg/µL。
   3. 从步骤 1.3.2 的各样品稀释液中各取 4 µL 加入孔板，使用 PCR 扩增仪运行反应。结合每次运行的 Cq 值与每孔 DNA 量，利用扩增仪软件的自动阈值设定功能绘制标准曲线。
   4. 采用标准 qPCR 操作程序，在扩增仪上进行 40 个循环的两步法扩增（98 °C 和 60 °C）。设定阈值，并将 ΔCt 值设为 >35，以确保兔源 VX2 细胞系中几乎无小鼠基因组污染。每个反应体系总体积为 10 µL，包含 5 µL 2× Mastermix、1 µL 正向与反向引物（终浓度为 250 nM）以及 4 µL DNA 模板。
      注意：设定阈值并将 ΔCt 值设为 >35，以确保兔源 VX2 细胞系中几乎无小鼠基因组污染。qPCR 可靠检测 VX2 DNA 的推荐浓度范围为 1–10 pg。

2. VX2 细胞培养及细胞悬液制备

1. 将含有 VX2 细胞的冻存管（步骤 1.2.7 中冻存）在 37 °C 水浴中解冻 1 分钟，转移至锥形离心管中，并加入 10 mL 培养基（1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素）。在 107 × g 条件下离心 8 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 9 mL 培养基中。
2. 将重悬的细胞转移至大培养瓶中。在 37 °C 条件下静置培养。每日使用光学显微镜检查细胞融合度，并每三天更换一次培养基。
3. 制备用于注射的培养 VX2 细胞悬液
   1. 当细胞融合度达到 80% 时，向培养瓶中加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶进行消化。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中 5 分钟。将消化液转移至锥形离心管中，在 107 × g 条件下离心 8 分钟，弃去上清液。
   2. 用 9 mL 磷酸盐缓冲液将细胞沉淀洗涤 3 次，每次均按上述方法离心并弃去上清液。计数细胞后，用 0.9% 磷酸盐缓冲液稀释至浓度为 4 × 10⁷ 个细胞/mL，并置于冰上保存于无菌锥形离心管中。
4. 制备用于注射的体内传代 VX2 细胞悬液
   1. 解冻冻存的 VX2 肿瘤组织块（1 cm × 1 cm），在培养皿中使用手术刀片切碎，并按照步骤 1.1.1 的方法通过 70 µm 滤网过滤。分次加入少量 HBSS，确保所有细胞均被过滤，最终体积为 1 mL。计数细胞后，用 0.9% 磷酸盐缓冲液稀释至浓度为 1 × 10⁷/mL，并置于冰上保存于无菌管中。
      注意： 肿瘤组织块由实验室合作者提供，来源于既往在兔股四头肌中传代的 VX2 肿瘤。

3. 手术模型建立

1. 手术麻醉的建立及术前准备
   1. 在计划手术前1小时，对雌性白色新西兰兔（体重2.5–3.5 kg）进行术前用药，注射乙酰丙嗪（1 mg/kg，肌内注射）和美洛昔康（0.2 mg/kg，皮下注射）。使用2–5%吸入异氟烷对雌性白色新西兰兔（体重2.5–3.5 kg）实施麻醉，去除注射部位的毛发，并用聚维酮碘溶液清洁注射部位。
   2. 使用喉罩气道（LMA）对麻醉后的兔子进行插管，并用胶带固定。通过调节吸入异氟烷剂量（维持在2–5%）以保持深度麻醉。在整个手术过程中定期监测外科麻醉深度，检查生命体征（呼吸频率、毛细血管再充盈时间、如有条件可监测血氧饱和度），并观察疼痛（活动、对刺激的回缩反应、发声）或浅麻醉（活动、咬LMA导管）的迹象。
      注意：此项操作应由具备外科麻醉监测经验的人员完成。
   3. 在耳缘背侧静脉置入22号静脉导管。在手术皮肤切口前10分钟，静脉注射头孢唑林（20 mg/kg）。
   4. 将兔子置于手术台前，先剪除骨盆和腹部的毛发，然后将兔子仰卧位放置于手术台上。采用三步法进行手术区域皮肤准备（聚维酮碘皂液、氯己定溶液、聚维酮碘溶液）。在标记耻骨上缘后，用剖腹手术巾铺巾，仅暴露下腹部约5 cm × 5 cm的区域。
2. 剖腹切口的建立及子宫角的识别
   1. 佩戴手术帽和口罩。使用氯己定或聚维酮碘外科洗手液进行手部刷洗。采用无菌技术穿戴无菌手术衣和无菌外科手套。
   2. 使用#11号刀片，在耻骨联合 cranial 1 cm处沿兔腹部皮肤及皮下组织做一条长约2.5 cm的切口。切开腹直肌筋膜，并向两侧分离腹直肌，暴露其下方的腹膜。确认下方无肠管或其他腹腔器官后，锐性切开腹膜。
   3. 通过识别膀胱，并用戴手套的手指向上、向后及向外侧滑过膀胱顶端，定位子宫角。
      注意：如有必要，可通过手指加压排空膀胱。定位后，将子宫角经腹壁切口拉出，置于腹壁表面。
   4. 使用3-0编织可吸收缝线，在每侧子宫角距宫颈约1.5–2.0 cm的远端位置进行单针结扎。缝线应位于沿子宫角外侧走行的子宫动脉稍内侧。牢固打结以闭塞远端子宫角（图1）。
3. 子宫肌层VX2接种
   1. 使用27号针头，将先前制备的VX2细胞悬液（来自步骤2.3.2，用于体外培养VX2模型，或步骤2.4，用于体内扩增VX2模型）各0.5 mL注射至每侧子宫角肌层，注射部位位于结扎线近端（结扎线与宫颈之间）。注射时间持续约1分钟，并确保细胞未注入下方子宫腔内。使用吸入异氟烷（2–5%）及带Bain回路的麻醉机维持动物麻醉状态。
   2. 注射后在肌层注射部位施加压力30秒，以减少细胞外漏。检查注射部位和结扎部位是否止血，并将子宫角放回腹腔内。
4. 关闭手术切口
   1. 腹壁深层关闭：识别腹膜切口顶端，用组织钳夹住腹膜、腹直肌及筋膜。
      1. 操作方法：在切口一端顶端固定缝线，一侧由浅至深进针，另一侧由深至浅出针，打结固定。利用该缝线，沿切口方向逐步进行垂直于切口的连续缝合，贯穿腹壁各层，从一侧向另一侧逐步推进。缝合完毕后打结并剪断缝线。
   2. 腹壁浅层关闭：识别皮肤切口顶端，使用埋藏式连续皮下3-0可吸收多股缝线缝合腹部皮肤。在闭合切口上涂抹外科胶水，以对合皮肤边缘。
      1. 操作方法：在切口一端顶端固定缝线，一侧由深至浅进针，另一侧由浅至深出针，打结固定。利用该缝线，在真皮层内平行于切口方向进行连续缝合，从一侧向另一侧逐步推进。缝合完毕后打结并剪断缝线。
5. 术后护理
   1. 麻醉苏醒：切口关闭后关闭异氟烷，让兔子通过面罩吸入氧气，同时监测苏醒迹象（如自主活动、睁眼、咀嚼喉罩导管等）。一旦出现上述迹象，立即拔管，并继续通过面罩供氧，同时提供保温毯，直至兔子清醒并能独立坐起。
   2. 术后监测：术后前4天每日监测两次，之后再持续10天每日监测一次。监测内容包括一般状况、食物和饮水摄入量、尿液和粪便排出情况、疼痛评估、体重、生命体征（心率、呼吸频率）以及手术部位是否存在肿胀、发红、分泌物或裂开。
   3. 术后镇痛：术后前48小时内每日皮下注射美洛昔康（0.2 mg/kg），之后根据疼痛评估结果按需给药。术后立即给予布托啡诺，并在术后24小时内每12小时一次（0.01–0.05 mg/kg，皮下注射），之后根据疼痛评估结果按需给药。
   4. 可根据兽医建议，术后每日肌内注射恩诺沙星（5 mg/kg）共7天，以预防伤口感染。根据脱水情况每日两次皮下注射液体（15 mL），并根据体重下降情况每日提供软食或其他营养补充剂。

结果

图1：子宫缝合。 黑色箭头 = 缝线，红色箭头 = 子宫角。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
11号刀片手术刀，无菌，一次性	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22号耳静脉导管	CDMV	14332
3-0 可吸收多股缝合线（Polysorb）	Covidien	356718
3-0 编织可吸收缝合线（Polysorb）	Covidien	356718
70 µm 细胞筛，独立包装，尼龙材质	Falcon	352350
乙酰丙嗪（Atravet）	CDMV	1047
聚维酮碘皂液（7.5% 聚维酮碘）	CDMV	4363
聚维酮碘溶液（10% 聚维酮碘）	UHN Stores	457955
丁丙诺啡	McGill University
头孢唑林	UHN 住院药房	无需货号
氯己定溶液	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware I 型胶原，100 mm 培养皿	Corning	354450	品牌不重要
Corning BioCoatCellware I 型胶原，24 孔板	Corning	354408	品牌不重要
Corning BioCoatCellware I 型胶原，6 孔板	Corning	354400	品牌不重要
Corning Matrigel 基底膜基质，*无动物源成分，10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	品牌不重要
DMSO	Caledon Lab Chem	10/1/4100
恩诺沙星（Baytril 注射液）	CDMV	11242
Falcon 离心管	Corning Centri-Star	430828
胎牛血清，经认证，加拿大来源，500 mL	Life Technologies	12483020	品牌/来源不重要
异氟烷	UHN 住院药房	无需货号
碘海醇造影剂	GE Healthcare	407141210
美洛昔康（Metacam 0.5%）	CDMV	104674
生理盐水	院内品牌（UofT 医药商店）	1011
PBS	Multicell 或 Sigma	331-010-CL 或 D8537-500mL
青霉素/链霉素（100 mL；10000 U 青霉素，10000 µg 链霉素）	Corning-Cellgro	CA45000-652
无菌 Hank's 平衡盐溶液（无 Ca++，无 Mg++，无酚红）	T.C.M.F (Dr Bristow)	2011年1月28日
外科粘合剂（组织粘合剂）	3M Vetbond	14695B
胰蛋白酶（0.25%），蛋白质组学级	Sigma	T-6567-5X20UG
胰蛋白酶-EDTA，0.05%，100 mL	Wisent Inc	325-542-EL	品牌不重要