建立用于成像质谱分析的卵巢癌通讯模型：一种鉴定转移性卵巢肿瘤发展中小分子化学信使的方法

摘要

来源：Zink, K. E. 等。利用成像质谱技术捕捉组织与细胞间的小分子通讯。J. Vis. Exp. (2019)

本方案描述了一种通过将卵巢组织外植体与输卵管癌细胞共培养来进行样品制备的技术。利用成像质谱技术（IMS）对这些样品进行观察，以检测细胞与组织之间的小分子交换，从而揭示肿瘤发生的相关机制。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 动物医学评审委员会的审查。

1. 共培养用氧化铟锡处理载玻片的设置与孵育

1. 未分隔共培养
   1. 在加热板上将琼脂糖加热至 70 °C 使其液化。
   2. 将 8 孔分隔器置于氧化铟锡（ITO）处理的载玻片上方（图 1A）。分隔器底部的橡胶有助于其与载玻片粘附，但在琼脂糖铺板过程中需持续施加轻柔的向下压力，以确保各孔之间无泄漏或混合。
   3. 将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中，离心（800 rpm，5 分钟），并用 1× DMEM 培养基重悬至每 150 μL 含 50,000 个细胞。若最适细胞密度不同，请确保此步骤中细胞悬液浓度为最终所需浓度的 2 倍（例如，若最终浓度为 300 μL 中含 50,000 个细胞，则此步骤中细胞密度应为 150 μL 中含 50,000 个细胞）。
   4. 在铺板细胞培养物之前，将卵巢组织块置于孔中央（图 1B）。
   5. 在即将铺板前，向各个细胞培养物对应的 2 mL 离心管中加入琼脂糖。每孔将 200 μL 细胞悬液与 200 μL 液化琼脂糖混合于一个 2 mL 管中。例如，对于四个孔，需混合 800 μL 细胞悬液与 800 μL 2% 琼脂糖。混合液会略有剩余，但多配制少量可避免移液时产生气泡。
      1. 在即将铺板前，立即向各个细胞培养物中加入琼脂糖。琼脂糖在不到一分钟内即会冷却，因此需准备好快速完成铺板。
   6. 立即向每孔中加入 300 μL 细胞/琼脂糖混合液（图 1C）。图 1C 展示了三种细胞条件和一种培养基条件，每种均分别与卵巢组织共培养和无卵巢组织培养。
   7. 将载玻片置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育。
2. 分隔共培养
   1. 从薄而光滑的塑料材料上切割分隔条（图 2A）。
      注意：本实验使用无菌一次性培养皿的侧壁，因其平整且薄。将其裁剪至刚好能紧密插入孔的斜边（约 13 mm 宽）。
   2. 在加热板上将琼脂糖加热至 70 °C 使其液化。
   3. 将 8 孔分隔器置于 ITO 处理的载玻片上方（图 2B）。分隔器底部的橡胶有助于其与载玻片粘附，但在琼脂糖铺板过程中需持续施加轻柔的向下压力，以确保各孔之间无泄漏或混合。

2. 干燥载玻片并准备进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

1. 四天后（或任何选定的时间点），从琼脂糖凝胶块和载玻片上移除腔室分隔器（图1D）。用平头刮刀轻轻将琼脂糖从腔室边缘剥离，并轻柔向上提起腔室，注意不要移动任何琼脂糖凝胶块。如果发生移动，请轻柔调整位置，确保各凝胶块互不接触。
2. 将载玻片放入37 °C烘箱中，加热约4小时，每隔1小时旋转90°。
   注意：旋转载玻片对于确保样品受热均匀至关重要。
3. 干燥后，从烘箱中取出载玻片（图1E）。
4. 使用喷雾器施加基质溶液（图1F），参数如下：温度 = 30 °C，流速 = 0.2 mL/min，喷雾次数 = 8次，方向 = CC，喷嘴距离 = 40 mm。
   注意：若无基质喷雾器，可使用艺术喷笔代替施加液态基质。可使用相同的基质溶液进行喷雾，但所需溶液体积约为两倍。将载玻片夹住使其垂直悬挂，从约一英尺远、90°角方向喷雾，直至可见基质层形成。
5. 在载玻片上的空白位置各加1 μL校准物（目标分子量<500 Da时使用磷红，目标分子量<5,000 Da时使用多肽混合物（见材料表））。磷红无需与基质混合，但多肽混合物需与基质按1:1比例混合以促进电离。等待校准物完全干燥。
6. 用永久性记号笔在载玻片的每个角落画一个“X”，并使用相机或扫描仪以1,200 dpi分辨率拍摄或扫描获取光学图像。

结果

图 1：未分割共培养样本制备的工作流程。（A）将 8 孔培养室粘附至 ITO 涂层载玻片的导电面。（B）将半侧卵巢置于各孔中央，以建立共培养条件。（C）直接向各孔中加入 300 μL 琼脂糖/细胞悬液。确保无气泡产生，且卵巢保持在孔中央位置。若加样过程中琼脂糖扰动了卵巢位置，应在琼脂糖冷却前，轻柔使用移液器吸头将其重新居中。（D）经过四天培养（或其他优化时间）后，将 8 孔培养室从载玻片上取下。若琼脂糖仍附着于培养室，可用刮勺轻轻将琼脂糖块从培养室剥离，并将其重新放置...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Denville	C1017-O	用于收集细胞
Millipore	PEZGS0816	重新利用 Millipore Millicell<br/> EZ-slide 培养腔室载玻片
Sigma-Aldrich	34998-4L	喷雾基质的溶剂
Eppendorf	5810 R	用于收集细胞并去除<br/> 上清液
Bruker Daltonic	8201344	喷洒至干燥载玻片上的基质
Bruker Daltonic	8201346	喷洒至干燥载玻片上的基质
Gibco	11995-065	与琼脂糖混合的培养基
Genesee Scientific	22-282	用于琼脂糖分装
Bruker	8237001	共培养孵育用平台
Sigma-Aldrich	A9414-10G	与培养基混合用于包板
Corning	4870	用于切割分隔室用的塑料隔板<br/>
Bruker Daltonic	8206195	中等质量范围校准物
Sigma-Aldrich	343-242-5G	低质量范围校准物
Sigma-Aldrich	E2758	细胞培养基添加剂
Peprotech Inc.	100-15	细胞培养基添加剂
Cellgro	30-005-CR	细胞培养基添加剂
Sigma-Aldrich	11074547001	细胞培养基添加剂
Gibco	25030-081	细胞培养基添加剂
Gibco	15140-122	细胞培养基添加剂
Fisher Technologies	A116-50	添加至基质溶液中
HTX Technologies		用于施加基质