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所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 金纳米星核的合成
注意：金纳米星被用作本实验中两种类型的SERRS纳米探针的核心。
- 在去离子水（DI水）中配制800 mL的60 mM抗坏血酸（C6H8O6）溶液，并在去离子水中配制8 mL的20 mM四氯金酸（HAuCl4）溶液。将两种溶液冷却至4 °C。
- 在4 °C下进行此反应步骤。将含有800 mL抗坏血酸溶液的锥形瓶置于磁力搅拌器上，形成稳定的漩涡。迅速将8 mL四氯金酸溶液加入漩涡中。数秒内将形成纳米星，溶液变为深蓝色。若溶液在任何时刻变为粉红色或紫色，表明生成了纳米球，应弃去该悬浮液并重新尝试合成。
- 将纳米星悬浮液倒入50 mL锥形管中，于4 °C、3,220 × g条件下离心20分钟。吸除上清液，每管中保留约200 µL溶液。注意不要扰动管底的纳米颗粒沉淀。
注意：由于仍有悬浮的纳米星存在，上清液应呈现蓝色色调。
- 使用微量移液器轻轻搅动溶液，使各管中的纳米颗粒重新悬浮并收集。部分沉淀可能紧贴管底难以分散，即使剧烈吹打也无法重悬——该部分应弃去。
- 将纳米颗粒悬浮液转移至透析盒（截留分子量3.5 kDa）中，用2 L去离子水透析至少三天，每天更换透析液。可在4 °C下将纳米星保存于透析液中长达一个月，每隔3–4天更换一次水。
注意：纳米星应持续保留在透析条件下，直至按第2节所述进行硅化反应时使用。
2. 二氧化硅壳的形成
注意：合成两种类型的拉曼纳米探针。两者的合成步骤相同，唯一区别在于所使用的拉曼报告分子（染料）。本实验中使用 IR780 高氯酸盐和 IR140。反应过程必须始终在塑料容器中进行。该合成方法具有高度可扩展性，可根据所需注射剂量调整规模。此处描述的是中等规模的合成，可根据需要线性放大或缩小至更低或更高体积，试剂浓度和反应时间保持不变。两种表面增强共振拉曼散射（SERRS）纳米探针的反应可并行进行，需注意避免交叉污染。在洗涤步骤中离心后或纳米颗粒储存超过一小时后，需通过超声处理重新分散纳米颗粒沉淀。超声处理应持续至纳米颗粒明显悬浮于溶液中，通常超声 1 秒即可。
- 在A管（50 mL锥形管）中，混合10 mL异丙醇、500 µL TEOS、200 µL去离子水和60 µL染料（高氯酸IR780或IR140，20 mM溶于DMF（二甲基甲酰胺））。
- 在B管（15 mL锥形管）中，混合3 mL乙醇和200 µL氢氧化铵。对第1.4步得到的纳米星进行超声处理以分散溶液中的聚集体，并将1.2 mL纳米星溶液加入该管中。
注意：氢氧化铵溶液具有高度挥发性，难以准确移液。建议在使用前将其保存于4 °C，以便于移液操作。
- 将A管置于涡旋混合器上，形成稳定的涡流。迅速将B管中的内容物加入涡流中，并继续混合约5秒。立即转移至摇床，在室温下以300 rpm振荡反应15分钟。
- 反应15分钟后，加入乙醇至50 mL管满，以终止反应。在4 °C条件下，以3,220 × g离心20分钟。
- 小心吸除上清液，保留约0.5 mL溶液，注意不要扰动沉淀。加入1 mL乙醇，用移液器吹打重悬纳米颗粒。转移至1.5 mL离心管中，通过在11,000 × g离心4分钟、吸除上清液，并用超声处理约1秒重新分散沉淀，重复此洗涤步骤共4次。
- 注意：在此阶段，硅化纳米颗粒可按照第3节所述进行功能化修饰，或额外增加一次洗涤步骤后重悬于去离子水中，于4 °C保存最多一周。
3. 表面功能化
注意： IR780 SERRS 纳米探针将通过 PEG 交联剂与叶酸受体靶向抗体偶联，形成 αFR-NPs；IR140 SERRS 对照纳米探针则将偶联钝化 PEG 单分子层，用于制备 nt-NPs。两种类型的纳米探针均通过巯基-马来酰亚胺反应在平行但独立的反应体系中形成。
- 通过在11,000 × g 条件下离心4分钟，吸除上清液，并用1 mL乙醇超声重悬沉淀，洗涤纳米颗粒两次。再重复洗涤一次，但将沉淀重悬于1 mL 85%乙醇、10% 3-MPTMS（3-巯基丙基三甲氧基硅烷）和5%去离子水中。在室温下孵育1–2小时，以在颗粒表面引入巯基。
- 将巯基功能化的纳米颗粒在11,000 × g 条件下离心4分钟，吸除上清液后通过超声重悬沉淀，依次用乙醇洗涤两次、去离子水洗涤两次，最后重悬于HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）缓冲液（10 mM，pH 7.1）中，置于一旁备用。
- 注意：应使用MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）缓冲液或HEPES缓冲液。盐浓度较高的缓冲液（如PBS，磷酸盐缓冲盐水）可能引起纳米颗粒聚集。
- 对于抗体功能化的αFR-NPs，将200 µg抗体（抗叶酸结合蛋白抗体克隆[LK26]）与十倍摩尔过量的PEG交联剂（聚乙二醇（N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯）醚N′-(3-马来酰亚胺丙酰基)乙胺，CAS: 851040-94-3）溶于500 µL MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中，反应30分钟。
- 使用离心过滤装置（截留分子量100 kDa）对抗体-PEG溶液进行离心，以去除过量交联剂并浓缩抗体。针对本研究中使用的离心过滤装置，在14,000 × g 和23 °C条件下离心10分钟。通过将滤膜装置倒置并以1,000 × g 离心2分钟，从新试管中回收偶联后的抗体。
- 将3.2步骤中的IR780纳米颗粒用移液器转移至含有抗体的试管中，并用移液器轻轻吹打混合。将混合物在室温下孵育至少30分钟，或在4 °C过夜，以形成αFR-NPs。
- 为制备nt-NPs，将1% w/v甲氧基封端的(m)PEG5000-马来酰亚胺（CAS: 99126-64-4）溶于DMSO后加入3.2步骤所得的IR140 SERRS纳米颗粒中，在500 µL MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中于室温反应至少30分钟，或在4 °C过夜。
- 用于小鼠给药（第4节）时，将两种类型的纳米探针均在11,000 × g 条件下离心4分钟，吸除上清液以去除未反应的游离抗体/PEG，然后分别重悬于MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中，浓度为600 pM。重悬纳米颗粒时，应尽量减少不必要的超声暴露，以防抗体变性。
4. 纳米探针注射与成像
- 按照第1-3节所述方法制备纳米探针（αFR-NPs和nt-NPs），并以1:1比例混合，使每种纳米探针在MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中的终浓度为300 pM。可选步骤：在小型（100 µL）锥形管中制备每种纳米探针30 pM的参考标准品。
- 向每只小鼠腹腔内注射1 mL纳米颗粒悬浮液，并轻轻按摩腹部以促进纳米颗粒在腹腔内的分布。将小鼠放回饲养笼中。25分钟或更长时间后，通过CO2 窒息法处死小鼠。
- 将小鼠固定于手术平台，呈仰卧位（若需进行全腹部成像，平台应可安装至直立式显微镜载物台上）。
- 使用有齿镊和解剖剪去除皮肤以暴露腹膜，并做一条2至3 cm长的矢状切口，充分暴露整个腹腔。将腹膜瓣固定在平台上。使用塑料冲洗瓶以至少60 mL PBS冲洗腹腔内部。
注意： 为实现无障碍的全腹部成像，需移动或切除肠管。若选择切除，应结扎肠系膜血管以减少腹腔内出血。
- 或者，在PBS冲洗后可将特定器官切除，并置于显微镜载玻片上用于成像。
- 将平台或载玻片转移至配备直立光学系统和电动载物台的拉曼显微光谱仪；使用商业系统，配备300 mW、785 nm的二极管激光器，光栅刻线密度为每毫米1,200条，中心波数设为1,115 cm-1。
- 使用白光光学系统对目标区域进行聚焦，该系统与拉曼激光共焦。选择待成像区域及所需分辨率；本研究中采用高速采集模式（在连续激光照射下采集光谱，同时显微镜载物台持续移动，有效空间分辨率为14.2 µm × 200 µm；物镜放大倍数为5×，激光功率100 mW，每点曝光时间<100 ms）。
注意： 可根据需要将第4.1步制备的含参考纳米探针的管子放置于成像区域内，作为后续分析的内部参考标准。确保除激光外无其他杂散光源进入物镜。
- 可选步骤：将样本在含4%多聚甲醛的PBS中于4 °C过夜固定，用于组织学处理与验证。在4 °C条件下用PBS漂洗至少两次，每次不少于15分钟。将样本保存于70%乙醇水溶液中，直至进行常规组织学处理及石蜡包埋。为验证肿瘤组织，可从石蜡块不同深度切取5 µm厚的切片，并进行苏木精-伊红（H&E）染色。