近端培养系统:一种研究细胞间旁分泌信号传导的体外培养技术

A. 细胞制备

1. 人原代间皮细胞的分离和培养
   1. 从人网膜中分离人原代间皮细胞 （HPMC），并在 37 °C 和 5% CO₂.
      的完全生长培养基 [含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素、1% 非必需氨基酸和 1% 维生素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM]）中培养它们 注意:HPMC 通常生长到 100% 汇合（图 1A）。
2. 卵巢癌细胞的生长条件
   1. 在 37 °C 和 5% CO₂.
      的完全生长培养基中培养 HeyA8 卵巢癌细胞 注意:使用生长至约 80% 汇合的 HeyA8 细胞（图 1B）。

B. 细胞培养

1. 近端培养设置
   1. 将 Transwell 插入物用于 6 孔板，该板具有 10 μm 厚的组织培养处理聚碳酸酯膜，孔径为 0.4 μm（10⁸ 孔/cm²）和 4.67 cm² 生长面积。如果需要，根据生长表面积缩放接种的细胞数量，针对不同的插入片段大小进行优化。使用前将完全生长培养基、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 加热至 37 °C。
2. 准备插件
   1. 要将 HeyA8 细胞接种在插入物膜的下表面，请使用无菌镊子从其包装中取出插入物，并将其倒置放入无菌的 15 cm 培养皿中。
   2. 使用 15 cm 的培养皿，因为它的深度足以容纳倒置的插入物，或用任何合适的无菌容器代替。根据实验，将所需数量的插入物放入 15 cm 培养皿中。
   3. 在插入物的边缘用标记相应地标记三个对照和三个实验条件。
3. 制备癌细胞
   1. 要在 25 cm² 培养瓶（~2 x 10⁶ 个细胞）中以 80% 汇合度生长的 HeyA8 细胞进行胰蛋白酶消化，加入 1 mL 胰蛋白酶 （0.25%） 40-60 秒，并用 6 mL 完全生长培养基中和胰蛋白酶。
   在
   2. 室温 （RT） 下以 500 x g 离心细胞 3 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL 完全生长培养基中。使用台盼蓝染料排除法对活细胞进行计数。
4. > 癌细胞接种
   1. 在完全生长培养基中悬浮 100,000 个细胞/mL 的活 HeyA8 细胞。小心地将 80,000 个 HeyA8 细胞悬浮在 800 μL 完全生长培养基中，位于插入物底部（现在朝上，因为它是倒置的）。
   2. 将细胞接种以形成圆顶状形状，使细胞保留在插入物上（图 1C）。从膜中心开始，以同心圆向外移动，同时缓慢移液。避免从边缘超过 3 毫米，以防止介质溢出。
      注意:接种的细胞数量将取决于细胞的生长速率和实验的持续时间。为该近端培养接种的 HeyA8 细胞数量得到优化，细胞在第 3 天结束时将达到 80-90% 的汇合度。
5. >癌细胞附着
   1. 盖上 15 cm 培养皿，小心地将包含插入片段的培养皿移至 CO₂ 培养箱中。在此步骤中，不要破坏插入片段上的培养基和细胞液滴，这一点至关重要。将细胞在 37 °C 下放置 4 小时，以使癌细胞附着在插入物上。
6. 制备间皮细胞
   1. 约 4 小时后，用胰蛋白酶 （0.25%） 对 75 cm² 培养瓶（~4 x 10⁶ 个细胞）中以 100% 汇合度生长的 HPMC 进行胰蛋白酶消化 1-2 分钟，然后用 12 mL 完全生长培养基中和胰蛋白酶。
   在
   2. RT 下以 500 x g 离心细胞 3 分钟，将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全生长培养基中，并使用台盼蓝染料排除法对活细胞进行计数。
7. 接种间皮细胞
   1. 在完全生长培养基中悬浮 300,000 个细胞/mL 的活 HPMC。向 6 孔板的每个孔中加入 2.5 mL 新鲜完全生长培养基。小心地将装有插入片段的 15 cm 培养皿取出到生物安全罩中。使用无菌镊子，翻转插入物并将其放入 6 孔板的孔中，使其直立，HeyA8 细胞附着在浸入完全生长培养基中的下表面（图 1C）。
   2. 将 450,000 个 HPMC 悬浮在插入物内部的 1.5 mL 生长培养基中接种，HeyA8 细胞附着在面向孔底部的表面上（图 1C）或没有任何 HeyA8 细胞的插入物用于 HPMC 对照。向 HeyA8 对照中加入 1.5 mL 不含细胞的生长培养基。
8. > 培养近端区域性
   1. 让近端培养物在 CO₂ 培养箱中在 37 °C 和 5% CO₂ 下生长 72 小时。如果需要，可以按以下方式补充培养基。
      1. 对于插入物的内部，去除 750 μL 并加入 750 μL 新鲜的完全生长培养基。
      2. 对于插入物的外部（6 孔板），去除 1 mL 并加入 1 mL 新鲜的完全生长培养基。选择 1 mL 是为了方便一步更换培养基。如果需要，可以取出 1.25 mL 并更换。

图 1:近端培养系统的组装。（A） 该图显示了人原代间皮细胞 （HPMC）。（B） 该图显示了 HeyA8 卵巢癌细胞。比例尺 = 200 μm （AB）。（C） 将 HeyA8 细胞接种在具有 0.4 μm 孔的 transwell 插入片段的下表面。细胞附着后，将插入片段置于含有生长培养基的 6 孔板的孔中。然后将间皮细胞接种在插入片段中，使它们附着在上表面，并通过膜与 HeyA8 细胞分离。膜中的 0.4 μm 孔允许分泌因子的交换，但抑制了细胞之间的任何直接接触。