近端共培养系统：一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的体外培养技术

摘要

来源：Dasari, S. 等. 一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的近端共培养方法. 视觉化实验杂志 (2018)

在本视频中，我们建立了一种卵巢癌细胞与原代人腹膜间皮细胞的近端共培养模型。这一具有生理相关性的模型可用于研究旁分泌信号传导，在防止细胞直接接触的同时，维持分泌因子的局部浓度。

方案

A. 细胞制备

1. 人原代间皮细胞的分离与培养
   1. 从人网膜组织中分离人原代间皮细胞（HPMCs），并在完全培养基 [含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1%维生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）] 中，于37 °C、5% CO₂ 条件下进行培养。
      注意： HPMCs 通常培养至100%汇合状态（图1A）。
2. ​卵巢癌细胞的培养条件
   1. 将HeyA8卵巢癌细胞在完全培养基中，于37 °C、5% CO₂ 条件下进行培养。
      注意： 使用培养至约80%汇合状态的HeyA8细胞（图1B）。

B. 细胞培养

1. 近端培养体系建立
   1. 使用适用于6孔板的Transwell插件，其含经组织培养处理的10 μm厚聚碳酸酯膜，孔径为0.4 μm（10⁸ 孔/厘米²）和一个4.67 cm² 生长区域。如有需要，可根据生长表面积按比例调整接种细胞数量，以优化不同插入片段大小的培养条件。使用前将完全培养基、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液（PBS）预热至 37 °C。
2. 准备插入片段
   1. 使用无菌镊子将插入物从包装中取出，倒置放入无菌的15 cm培养皿中，以在插入物膜的下表面接种HeyA8细胞。
   2. 使用直径为15 cm的培养皿，因其深度足以容纳倒置的插入式培养小室，也可替换为其他合适的无菌容器。根据实验需要，将所需数量的插入式培养小室放入15 cm培养皿中。
   3. 用记号笔在插入物的边缘相应地标记三个对照组和三个实验组。
3. 准备癌细胞
   1. 将生长至80%汇合度的HeyA8细胞进行胰蛋白酶消化处理² 烧瓶（约 2 x 10⁶ 细胞），加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化40–60秒，随后加入6 mL完全培养基中和胰蛋白酶。
   2. 以 500 x g 离心细胞 g 室温（RT）孵育3分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL完全培养基中。使用台盼蓝染色排除法计数活细胞。
4. 接种癌细胞
   1. 将活的HeyA8细胞用完全培养基重悬至100,000个细胞/mL。轻轻将800 μL完全培养基中含80,000个HeyA8细胞的细胞悬液接种至插入式培养小室的底部（此时底部朝上，因已倒置）。
   2. 将细胞接种成穹顶状，以确保细胞保留在小室插件上（图1C从膜的中心开始，一边缓慢移液，一边以同心圆方式向外移动。避免距离边缘超过3 mm，以防培养基溢出。
      注意： 接种的细胞数量取决于细胞的生长速率和实验持续时间。本近端共培养实验中接种的HeyA8细胞数量已优化，至第3天结束时细胞融合度将达到80–90%。
5. 癌细胞黏附
   1. 盖上15 cm培养皿，小心移动含有插入式培养小室的培养皿至CO₂培养箱₂ 培养箱中。此步骤中切勿扰动插入物上的培养基液滴及细胞。将细胞置于37 °C孵育4小时，以使癌细胞贴附于插入物上。
6. 制备间皮细胞
   1. 约4小时后，将75 cm²培养瓶中生长至100%汇合度的腹膜间皮细胞（HPMCs）进行胰蛋白酶消化。² 烧瓶（约 4 x 10⁶ 用2 mL胰蛋白酶（0.25%）消化细胞1–2分钟，然后加入12 mL完全培养基中和胰蛋白酶。
   2. 以 500 x g 离心细胞 g 室温孵育3分钟，将细胞沉淀重悬于10 mL完全培养基中，使用台盼蓝染色排除法计数活细胞。
7. 接种间皮细胞
   1. 将活的HPMC细胞以300,000个细胞/mL的浓度悬浮于完全培养基中。向6孔板的每孔加入2.5 mL新鲜完全培养基。小心地将含有小室的15 cm培养皿移至生物安全柜中。使用无菌镊子将小室翻转，轻轻放入6孔板的孔中，使其保持直立状态，使附着于下表面的HeyA8细胞浸入完全培养基中（图1C).
   2. 将450,000个HPMC细胞悬液（体积为1.5 mL）接种至嵌套小室内部，使HeyA8细胞附着于面向孔板底部的表面图1C）或仅含基质但不含HeyA8细胞的插入式培养小室，用于HPMC对照组。向HeyA8对照组中加入1.5 mL不含细胞的生长培养基。
8. 扩增近端培养物
   1. 让近端培养物在CO₂培养箱中继续生长₂ 37 °C、5% CO₂ 培养箱₂ 72小时。如有需要，可按如下方法补充培养基。
      1. 对于插入物内部，移除750 µL培养基，并加入750 µL新鲜的完全生长培养基。
      2. 对于插入物的外侧（6孔板），移除1 mL培养基并加入1 mL新鲜的完全生长培养基。选择1 mL是为了方便一步完成换液操作。如有需要，也可移除并替换1.25 mL。

结果

图1：近端共培养系统的构建。（A）本图显示人原代间皮细胞（HPMCs）。（B）本图显示HeyA8卵巢癌细胞。比例尺 = 200 µm（A-B）。（C）将HeyA8细胞接种于Transwell小室的下表面，小室膜孔径为0.4 µm。待细胞贴壁后，将小室置于含生长培养基的6孔板孔中。随后将间皮细胞接种于小室内部，使其贴附于膜的上表面，从而与下表面的HeyA8细胞被膜隔开。膜上0.4 µm的孔径允许分泌因子的交换，但阻止细胞间的直接接触。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 mm Transwell 可渗透支持装置，带 0.4 &micro;m 孔径聚碳酸酯膜插入物	Corning (Costar)	3412	&bull; 10 &micro;m 厚半透明聚碳酸酯膜。<br/> &bull; 经处理以实现最佳细胞贴附。<br/> &bull; 每个包装含 6 个插入物，置于 6 孔板中，每箱 4 块板。<br/> &bull; 膜需染色以使细胞可见。<br/> &bull; 采用伽马射线灭菌。
6 孔板	Corning (Falcon)	353046	平底，TC 处理，无菌，带盖
15 cm 培养皿	Corning (Falcon)	353025	无菌，TC 处理细胞培养皿
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
青霉素-链霉素	Corning	30-002-CI
MEM 非必需氨基酸	Corning (Cellgro)	25-025-CI
移液管			&nbsp;任何品牌均可
CO2 培养箱			&nbsp;任何品牌均可
生物安全二级柜&nbsp;			&nbsp;任何品牌均可