在腹膜腔衬里中模拟卵巢癌转移：一种建立腹膜衬里体外三维模型的方法

摘要

来源：Peters, P. N. 等. 在人腹膜腔的器官型培养中模拟卵巢癌扩散的早期步骤. J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们演示了以下内容的开发过程  一个 体外  腹膜腔衬里三维模型。这种器官型培养有助于研究卵巢癌细胞的黏附、侵袭和增殖。

方案

1. 器官型培养物的铺板

1. 通过加入 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，随后加入 3 ml 0.25% 胰蛋白酶/25 mM EDTA 消化不超过 5 分钟，从 75 cm² 培养瓶中解离正常大网膜成纤维细胞（NOF ）。用至少三倍体积的完全生长培养基中和胰蛋白酶。
2. 将消化后的细胞转移至 50 ml 圆底离心管中，在 0.5 g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，并用 5 ml 完全生长培养基重悬细胞。使用细胞计数仪对从培养瓶中回收的细胞进行计数。
3. 将细胞用适量完全生长培养基稀释后，以每 100 µl 接种 2,000–4,000 个 NOF 的密度接种至黑色、透明底的 96 孔板中。在接种前，向细胞悬液中加入 0.5 µg/100 µl 大鼠尾胶原 I。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 、湿度充足的环境中静置至少 4 小时，或直至细胞完全贴壁。
4. 使用与步骤 1.1 和 1.2 相同的方法从培养瓶中解离原代人腹膜间皮细胞（HPMC）。将细胞用适量完全生长培养基稀释后，以每 50 µl 接种 10,000–20,000 个 HPMC 的密度接种至已铺有胶原 I 并接种了 NOF 的 96 孔板中。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 、湿度充足的环境中静置至少 18 小时，然后开始实验。
5. 在完全生长培养基中培养表达绿色荧光蛋白（GFP）的 HeyA8 卵巢癌细胞。HeyA8 卵巢癌细胞通过表达携带桡足类 cGFP（pCDH-CMV-MCS-EF1）的慢病毒载体实现荧光标记。实验当天，HeyA8 卵巢癌细胞应达到 80–90% 汇合度（处于对数生长期）。使用与步骤 1.1–1.2 中所述原代细胞相同的方法从培养板中解离细胞并进行计数。
6. 将卵巢癌细胞置于锥形管中，在 37°C 的完全生长培养基中静置恢复 15–20 分钟 ，管盖保持松动。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	费舍尔科技	SH3001304
15 cm 培养皿	BD 生物科学	353025
含 L-谷氨酰胺的 DMEM	康宁	10-013-CV
MEM 维生素	康宁	25-020-Cl
MEM 非必需氨基酸	康宁	25-025-CI
青霉素-链霉素	康宁	30-002-CI
摇床	赛默飞世尔	MaxQ 4450
离心机	艾本德	5702
培养箱	赛默飞世尔	Forma Series II Water Jacketed CO2 培养箱 Model 3100
胰蛋白酶 EDTA，1x (0.25%)	康宁	25-053-CI
T-75 培养瓶	BD 生物科学	353136
T-175 培养瓶	BD 生物科学	353112
移液器吸头	Rainin	P2、P10、P20、P200 和 P1000
移液器吸头	康宁	带滤芯吸头 P2、P10、P20、P200 和 P1000
细胞计数仪	英潍捷基	Countess
Countess 细胞计数板 载玻片	英潍捷基	C10313
台盼蓝染液 (0.4%)	吉布科	15250-061
Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾来源）	BD 生物科学	354236
96 孔板，透明底，黑色	BD 生物科学	353219