间皮细胞分离：一种从人网膜组织标本中分离原代间皮细胞的技术

摘要

来源：Peters, P. N. 等. 利用人腹膜腔的类器官培养模型研究卵巢癌扩散的早期步骤. J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了从人网膜标本中分离原代人腹膜间皮细胞的实验方案。分离得到的间皮细胞可用于建立 体外 卵巢癌模型，用于研究卵巢癌细胞的黏附、侵袭和增殖。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 原代未转化间充质细胞的分离与培养

1. 人体组织的采集与制备
   1. 获取2 cm的人体大网膜标本³，于腹部手术中取出后，立即将组织浸入室温磷酸盐缓冲液（PBS）中（图1A一块3 cm × 2 cm的大网膜通常可获得100万个原代人腹膜间皮细胞（HPMC）和20万个原代人成纤维细胞或正常大网膜成纤维细胞（NOF）。
   2. 将组织浸泡过的 PBS 以 0.5 × g 离心 g 采集后应尽快离心3分钟（< 2小时，PBS）后，将组织转移至含有20 ml新鲜PBS的50 ml锥形管中。在直径15 cm的无菌培养皿中，用手术刀将组织切成5 mm³大小的组织块。图1B）。
2. 原代人腹膜间皮细胞的分离
   1. 将切碎的组织转移至50 ml锥形管中，静置1分钟，使组织碎片上浮至液面，以分离HPMC （图1C） & D). 管底液体中将含有 HPMC 和红细胞（RBC）。使用移液器将管底液体转移至新的离心管中。在 0.5 × g 条件下离心沉淀该液体 g 3 分钟后，吸除 HPMC/红细胞沉淀物的上清液。
      1. 重复该步骤三次：向剪碎的组织中加入 20 ml PBS，静置使组织沉淀，用移液器从底部吸取液体至 HPMC/RBC 管中，离心，弃去上清液。完成所有离心步骤并吸除上清液后，沉淀物中将含有 HPMC 和 RBC。
   2. 将沉淀中的所有细胞接种至一个75 cm²培养瓶中² 在15 ml完全培养基（DMEM，含10%胎牛血清[FBS]、1% MEM维生素[93 mg/L]、1% MEM非必需氨基酸[81.4 mg/L]、1%青霉素-链霉素[Pen-Strep，100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素]）中培养。
   3. 进行二次PBS洗涤以分离更多的腹膜间皮细胞。
      1. 对于第二次 PBS 洗涤，将剩余的固体组织在 20 ml PBS 中于 37 °C、200 rpm 振荡 10 分钟，然后静置 1 分钟使组织上浮至液面。从管底吸出液体转移至新管，以 0.5 x g 3 分钟后，吸除上清液。
      2. 将二次 PBS 清洗所得的全部 HPMC/RBC 接种于另一 75 cm² 培养瓶中² 在15 ml完全培养基中培养锥形瓶。
   4. 为了分离残留的 HPMC，将切碎的组织在 20 ml 体积比为 1:1 的 0.25% 胰蛋白酶 25 mM EDTA : PBS 溶液中，于 37 °C、200 rpm 条件下振荡 10 分钟。静置使组织沉淀，收集管底液体至新的 50 ml 离心管中，于 0.5 × g 离心沉淀 g 3 分钟。
      1. 吸弃上清液，并将全部 HPMC/RBC 接种至另一个 75 cm² 培养瓶中² 在15 ml完全培养基中培养锥形瓶。
   5. 将接种的细胞在 37°C 和 5% CO₂ 条件下培养₂ 在湿润环境中培养。在第3天和第5天，直接加入15 ml完全培养基以喂养已贴壁的细胞，无需移除旧培养基。HPMC可在传代前培养5–7天。
      1. 所有实验均使用低代次 HPMC（传代次数不超过 2 代），以尽量减少去分化及原始表型的改变。细胞成像应使用配备塑料差分干涉（DIC）功能的宽场显微镜，优先选用 20× 物镜，或配备相差功能（显微镜上装有相差滤光片）的 4–20× 物镜；分析免疫组织化学 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色时，使用 10× 物镜在明场下观察。
   6. 通过免疫组织化学染色确认HPMC呈立方形，并表达细胞角蛋白8和波形蛋白 （图 2A、C、E）.

结果

图 1. 原代人网膜细胞的分离。 (A) 手术中采集一块网膜组织置于 PBS 中，并运送至实验室。组织在 0.5 × g 条件下离心 3 分钟，沉淀后转移至新鲜 PBS 中。(B) 将网膜组织转移至一个 10 cm 的培养皿中，用 PBS 洗涤，并使用手术刀将网膜切成小块（0.5 cm³）。(C-D) 使用 25 ml 血清移液管收集组织块，并转移至 50 ml 锥形管中以分离 HPMC。去除 PBS 后，在 37°C 下以 0.5 × g 离心，使 HPMC...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	费舍尔科技	SH3001304
单刃剃刀片	费舍尔科技	12-640
15 cm 培养皿	BD 生物科学	353025
胎牛血清（FBS）	生命技术公司	16000044_3616914956
含 L-谷氨酰胺的 DMEM 培养基	康宁公司	10-013-CV
MEM 维生素溶液	康宁公司	25-020-Cl
MEM 非必需氨基酸溶液	康宁公司	25-025-CI
青霉素-链霉素 	康宁公司	30-002-CI
摇床	赛默飞世尔科技	MaxQ 4450
离心机	艾本德	5702
培养箱	赛默飞世尔科技	Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
T-75 培养瓶	BD 生物科学	353136
T-175 培养瓶	BD 生物科学	353112
移液器吸头	Rainin	P2、P10、P20、P200 和 P1000
显微镜	蔡司	Axiovert 200m
抗整合素 αVβ3 抗体，克隆号 LM609	EMD Millipore	MAB1976
Beta 1	Oncosynergy	OS2966
Alpha 5 [CD49e]	ID Pharmingen	555615
Beta 4 [CD104]	EMD Millipore	MAB 2058
移液器吸头	康宁公司	带滤芯吸头 P2、P10、P20、P200 和 P1000
玻璃烧瓶