间皮细胞分离:一种从人网膜组织标本中分离原代间皮细胞的技术

摘要

来源:Peters， P. N. et al. 在人体腹膜腔的器官型培养中模拟卵巢癌播散的早期步骤。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频描述了从人网膜标本中分离原代人间皮细胞的方案。间皮细胞可用于建立体外卵巢癌模型，以研究卵巢癌细胞的粘附、侵袭和增殖。

方案

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 原代未转化基质细胞的分离和培养

1. 人体组织采集和制备。
   1. 获取在腹部手术中去除的人网膜标本，2 cm³，并立即将组织浸入 RT 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中（图 1A）。一块 3 cm x 2 cm 的网膜通常产生 100 万个原代人间皮细胞 （HPMC） 和 200,000 个原代人成纤维细胞或正常网膜成纤维细胞 （NOF）。
   2. 收集后尽快将 PBS 离心，将组织以 0.5 x g 的浓度浸入 3 分钟（在 PBS 中< 2 小时），然后将组织转移到 50 ml 锥形管中的新鲜 20 ml PBS 中。用手术刀在直径为 15 cm 的无菌培养皿中切碎，将组织切成 5mm 3 的块（图 1B）。
2. 原代人间皮细胞分离
   1. 为了分离 HPMC，将切碎的组织转移到 50 ml 锥形管中，等待 1 分钟，让固体块漂浮到顶部（图 1C & D）。HPMC 和红细胞 （RBC） 将存在于底部的液体中。使用移液管将液体从试管底部取出，并放入新的锥形管中。将液体以 0.5 x g 离心 3 分钟，然后从 HPMC/RBC 沉淀中吸出上清液。
      1. 重复该过程 3 次:向切碎的组织中添加 20 ml PBS，让组织上升，用移液管从底部除去液体并进入 HPMC/RBC 管，离心，并去除上清液。在所有旋转完成并吸出上清液后，沉淀将含有 HPMC 和 RBC。
   2. 将沉淀中的所有细胞接种到 75 cm² 烧瓶中，溶于 15 ml 全生长培养基（含 10% 胎牛血清 [FBS]、1% MEM 维生素 [93 mg/L]、1% MEM 非必需氨基酸 [81.4 mg/L]、1% 青霉素链霉素 [Pen-Strep、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素]）中。
   3. 进行二次 PBS 洗涤以分离其他 HPMC。
      1. 对于二次 PBS 洗涤，在 20 ml PBS 中以 200 rpm、37 °C 摇动剩余的实体组织 10 分钟，然后等待 1 分钟，让组织漂浮到顶部。将液体从试管底部取出到新试管中，以 0.5 x g 离心 3 分钟，然后吸出上清液。
      2. 将来自二级 PBS 洗涤液的所有 HPMC/RBC 接种在单独的 75 cm² 烧瓶中，溶于 15 ml 全生长培养基中。
   4. 为了分离任何剩余的 HPMC，在 20 ml 1:1 0.25% 胰蛋白酶 25 mM EDTA:PBS 溶液中以 200 rpm、37 °C 的速度摇动切碎的组织 10 分钟。让组织上升，将管底部的液体收集到新的 50 ml 管中，并以 0.5 x g 的速度旋转 3 分钟。
      1. 吸出上清液，将所有 HPMC/RBC 接种在单独的 75 cm² 烧瓶中，溶于 15 ml 全生长培养基中。
   5. 在潮湿的环境中，在 37°C 和 5% CO₂ 下培养铺板的细胞。通过在第 3 天和第 5 天加入 15 ml 全生长培养基来喂养铺板的细胞，而不去除用过的培养基。HPMC 可以在分裂前培养 5-7 天。
      1. 在所有实验中使用低传代 HPMC（直至第 2 代），以尽量减少原始表型的去分化和修饰。使用宽视场显微镜，最好配备具有塑料微分干涉对比功能的 20 倍物镜或具有相差功能的 4-20 倍物镜（显微镜上的相差滤光片）来拍摄细胞的所有图像，并使用明场中的 10 倍物镜 （） 来分析免疫组织化学 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB） 染色。
   6. 通过进行免疫组织化学确认 HPMC 是立方体并表达细胞角蛋白 8 和波形蛋白（图 2A、C、E）。

结果

图 1.原代人网膜细胞的分离。（A） 在手术时在 PBS 中收集一块网膜并运送到实验室。将组织以 0.5 x g x 3 分钟沉淀并转移至新鲜 PBS 中。（B） 将网膜片转移到 10 cm 培养皿中，用 PBS 洗涤，用手术刀将网膜切成小块 （0.5 cm3）。（C-D）使用 25 ml 血清移液管收集组织块并转移到 50 ml 锥形管中以分离 HPMC。从管中取出PBS，并在37°C下从PBS中沉淀0.5 x g HPMC。（MC，间皮细胞，红细胞，红细胞，Fib，成纤维细胞）（E）与透明质酸酶和III型胶原酶孵育后，从剩余的网膜组织中分离NOF。该图像显示了消化 6...

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