建立小鼠网膜组织外植体中荧光标记卵巢癌细胞定植乳斑的离体模型方法

摘要

来源：Krishnan, V. 等。体内与离体研究卵巢癌转移定植腹膜脂肪中乳斑结构的方法。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们建立了一种体外大网膜器官培养体系，并在其上覆盖表达绿色荧光蛋白（GFP）的卵巢癌细胞，以研究卵巢癌细胞在大网膜外植体内的定植过程。该实验方案用于分析大网膜中被称为乳斑的免疫细胞结构，这些结构可促进肿瘤转移。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 体外乳斑定植

1. 大网膜组织体外基础培养条件的建立
   1. 将每块大网膜放入单独的培养板插件中，并置于含有500 µl含20%胎牛血清的DME/F12培养基的12孔组织培养板的单个孔内。将器官培养物置于37 °C、5% CO₂的培养环境中维持培养。₂ 环境培养24至48小时和/或额外的时间点。每种条件使用三个独立的大网膜（三个重复样本）。例如， 培养基类型/时间点
   2. 为确认实验终点时组织的完整性，按照步骤 1.1.3 中所述方法固定并处理样品。在 H&E切片可用于评估组织完整性。需从五个生物学样本中至少获取约120个细胞，以计算存活组织所占百分比。
   3. 为测量组织功能，将网膜组织（n=3）分别置于含有500 µl含20% FCS的DME/F12培养基的24孔板的不同孔中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育，使网膜组织对培养基进行条件化处理。₂ 在环境中孵育24小时后，移除250 µl用于IL-6 ELISA检测。
2. 小鼠网膜与SKOV3ip.1-GFP细胞的离体共培养
   1. 培养并制备荧光标记的细胞，通过移液加入1x10⁶  在T-75培养瓶中加入10 ml培养基重悬冻存细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 环境培养至70%汇合度。胰酶消化后重悬于浓度为2 x 10⁶ 每毫升细胞数
   2. 在培养小室的膜上滴加约 6 µl 组织粘合剂，并使其自然风干。用无菌水洗涤膜两次，以去除多余的粘合剂。在超净工作台中将膜风干。
   3. 使用无菌镊子仔细切除大网膜，并将其贴附于涂有黏合剂的膜上。在加入培养基之前，让组织在膜上贴附1分钟。在每个培养插件中的每片大网膜上方加入500 µl细胞悬液。在Transwell小室周围区域加入2.5 ml DME/F-12培养基。
   4. 在37 °C、5% CO₂条件下，将网膜与细胞悬液共同孵育6小时₂ 环境。用约10 ml PBS小心移除并清洗大网膜。使用适当的荧光成像系统观察荧光标记的癌细胞病灶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖工具	Fine Science Tools	NA
吉姆萨染液	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% 甲醛	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
PBS	Corning	21-040-CV	不含钙和镁
胶原酶	Worthington	LS004196
Millicell 培养板插件	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240