间皮清除实验：一种体外定量评估卵巢癌球体侵袭间皮细胞单层能力的技术

摘要

来源：Davidowitz, R. A. 等。模拟卵巢癌转移早期步骤的体外间皮清除实验。 J. Vis. Exp. (2012)

本视频介绍了一种利用荧光标记细胞和延时视频显微镜定量测量卵巢癌球状体与间皮细胞相互作用的技术。该体外实验模型用于模拟转移性卵巢癌细胞球状体与腹膜腔内衬间皮细胞之间的相互作用。 体内.

方案

1. 卵巢癌细胞球体的形成

1. 在10%基础培养基（一种定制的细胞培养基，含有199与MCDB105培养基按50:50比例混合、10%灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液）中培养表达RFP的卵巢癌细胞。若需在未标记的卵巢癌细胞中表达RFP，可将细胞转染含有RFP的质粒，并筛选出表达RFP的细胞。或者，也可使用病毒载体瞬时表达荧光蛋白，或预先将细胞与红色荧光细胞示踪染料（Invitrogen）共孵育。
2. 在形成卵巢癌细胞球之前，需准备低吸附96孔圆底培养板。为制备低吸附培养板，向96孔细胞培养板的每孔中加入30 μL聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯（poly-HEMA）溶液（6 mg聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯溶于1 mL 95%乙醇中）。将96孔板置于37 °C非湿润培养箱中孵育，使乙醇挥发，从而在每孔表面形成一层poly-HEMA薄膜。该poly-HEMA薄膜可防止细胞贴附于孔底，迫使细胞在悬浮状态下生长。[也可直接使用超低吸附培养板（Corning）。]
3. 随后，用胰蛋白酶消化卵巢癌细胞，在台式离心机（Heraeus）中以900 RCF离心3分钟收集细胞。吸除上清液后，用10%基础培养基重悬细胞。
4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
5. 调整细胞浓度，使每50 μL 10%基础培养基中含有100个细胞。
6. 将均匀悬浮的稀释细胞悬液50 μL加入至已涂覆poly-HEMA的96孔培养板的每孔中。
7. 将96孔板置于37 °C细胞培养箱中孵育16小时（具体时间可根据特定细胞系形成多细胞球所需时间或实验设计需求适当延长或缩短），以使卵巢癌细胞聚集并形成单个多细胞球体。部分肿瘤细胞在此期间可能发生凋亡，因此必须选择在凋亡诱导前的时间点进行后续操作。

2. 间皮细胞单层的形成

1. 在细胞培养超净台中，通过向 MatTek 培养皿的每个孔中加入 2 mL 浓度为 5 μg 纤连蛋白/mL 的 PBS 溶液，室温孵育 30 分钟，对 6 孔玻璃底 MatTek 培养皿的孔进行预包被。MatTek 培养皿玻璃底的光学质量可支持高分辨率显微成像。
2. 表达 GFP 的间皮细胞在 10% 基础培养基中培养。用胰蛋白酶消化一皿间皮细胞，在台式离心机（Heraeus）中以 900 RPM 离心 3 分钟，吸除上清液，并用 10% 基础培养基重悬细胞。此处使用的间皮细胞在获取时已表达 GFP，但未标记的间皮细胞可通过转染含 GFP cDNA 的质粒，或预先用绿色荧光细胞示踪染料（Invitrogen）孵育细胞来制备。
3. 完成 30 分钟纤连蛋白孵育（步骤 2.1）后，用 2 mL PBS 洗涤 MatTek 培养皿的各孔。
4. 吸除 PBS，将 6 × 10⁵ 个间皮细胞接种至 6 孔 MatTek 培养皿的每个孔中。将 MatTek 培养皿置于 37 °C 细胞培养箱中过夜孵育，使间皮细胞贴壁并形成单层细胞层。

3. 间皮细胞清除实验

1. 使用移液器从96孔聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的培养板中收集卵巢癌球状体。
2. 吸除含有间皮细胞单层的一孔6孔MatTek培养皿中的培养基，用2 mL PBS洗涤一次。将96孔板中的所有球状体加入MatTek培养皿的一孔中（球状体数量约为拟成像数量的3倍，以补偿落在无法成像区域的球状体）。
3. 将MatTek培养皿置于倒置宽场荧光显微镜的载物台上，该显微镜需具备至少8小时的时间序列成像能力。使用电动载物台在同一实验中对培养皿内多个位置进行成像，以捕获多个球状体嵌入事件。我们使用的设备为尼康Ti-E倒置电动宽场荧光时间序列显微镜，配备集成的Perfect Focus系统、低倍率[20×-0.75数值孔径（NA）] / NA微分干涉差（DIC）光学系统、尼康卤素透射光源与0.52 NA长工作距离（LWD）聚光镜、尼康快速（<100毫秒切换时间）激发和发射滤光片（GFP激发480/40，发射525/50；RFP-mCherry激发575/50，发射640/50）、Sutter快速透射与落射荧光光路智能快门、尼康线性编码电动载物台、Hamamatsu ORCA-AG冷却电荷耦合器件（CCD）相机、定制的显微镜培养箱（具备温度和CO₂控制功能）、尼康NIS-Elements AR软件版本3，以及TMC防振台。
4. 卵巢癌细胞球状体会沉降至培养皿底部并附着于间皮细胞单层。每10分钟采集20个以上球状体与单层细胞相互作用的GFP、RFP和相差图像，持续8小时。
5. 表达RFP的卵巢癌细胞球状体会侵入表达GFP的间皮细胞单层，从而在单层中形成空洞。8小时后，使用Elements软件（或其他适用软件如ImageJ）在GFP图像中勾画黑色空洞区域以测量空洞大小。通过将8小时时空洞大小除以零时对应RFP图像中球状体的初始大小，对空洞大小进行归一化处理。本示例中仅测量了一次空洞大小，但可在整个8小时实验过程中多次测量，以更深入理解嵌入过程的动力学特征。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
OVCA433 卵巢癌细胞			由 Dennis Slamon 博士惠赠
ZT 间皮细胞			由 Tan Ince 博士惠赠
Medium 199	GIBCO by Life Technologies	19950
MCDB105	Cell Applications Inc.	117-500
FBS-热灭活	GIBCO, by Life Technologies	10082
青霉素-链霉素（Pen-Strep）	GIBCO, by Life Technologies	15070
96 孔板	Corning	3799
聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）  192066-25G	Sigma-Aldrich		配制 poly-HEMA 溶液：将 6 mg poly-HEMA 粉末溶于 1 ml 95% EtOH 中
EtOH	Pharmco-AAPER	111ACS200	用 dH₂O 稀释至 95%
细胞培养超净台	Nuaire	NU-425-300
组织培养孵箱	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3110
poly-HEMA 板专用孵箱 305	Labline Instruments	Imperial III
台式离心机	Heraeus Instruments	75003429/01
6 孔玻璃底培养皿	MatTek Corp.	P06G-1.5-20-F
纤连蛋白（Fibronectin）	Sigma-Aldrich	F1141-1MG
PBS	Cellgro	21-040-CV
显微镜	Nikon Instruments		Ti-E 倒置电动荧光延时显微镜，配备集成的 Perfect Focus 系统
物镜	Nikon Instruments		20X-0.75 数值孔径
卤素透射光源	Nikon Instruments		0.52 NA 长工作距离聚光镜
激发与发射滤光片	Chroma Technology Corp.		GFP 激发 480/40，发射 525/50；RFP/mCherry 激发 575/50，发射 640/50
透射光与落射荧光光路	Sutter Instrument Co.		智能快门
线性编码电动载物台	Nikon Instruments
冷却型电荷耦合器件相机	Hamamatsu Corp.	ORCA-AG
带温度与 CO₂ 控制的显微镜培养室			定制
防振台	TMC
NIS-Elements 软件	Nikon Instruments		版本 3