确定癌细胞的最佳抑制性肿瘤治疗场频率:一种评估 TTFields 对癌细胞活力影响的无创体外方法

1. TTFields 体外应用系统 - 底板和培养皿维护

1. 用流来的自来水冲洗餐具和碗碟盖。然后，用去离子水冲洗并面朝下风干。
2. 如果在之前的实验中已将化疗剂/药物添加到培养皿中，请在每个培养皿中加入 5% 的轻质洗涤剂溶液并放置过夜。
   1. 用流动的自来水彻底冲洗餐具，以免餐具内有任何洗涤剂痕迹。用去离子水冲洗盘子和碗盖，面朝下风干。
3. 将干净干燥的盘子连同盖子插入消毒袋中。密封袋子并将其放入高压灭菌器中，培养皿面朝下。在不高于 121 °C 的温度下高压灭菌 30 分钟。
4. 将高压灭菌器设置为干燥程序，部分打开高压灭菌器门，然后将餐具干燥 30 分钟。
5. 用蘸有 70% 乙醇的布擦拭底板。

2. 实验设置

注意:本协议中使用的所有设备和材料都在材料列表中进行了描述。以下所有步骤都应在层流柜内进行，同时保持无菌条件。

1. 按照第 1 节所述，准备干净无菌的 TTFields 培养皿和盖子。用蘸有 70% 乙醇的布擦拭底板。
2. 轻轻按下培养皿并顺时针旋转约 5 mm，直到培养皿边缘锁定在底板上，将带盖的 TTFields 培养皿安装到底板上。将无菌的 22 毫米盖玻片（处理过的塑料或玻璃）放在每个培养皿的底部。
3. 在完全生长培养基（用于 U-87 MG 和 F98 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基;用于 A2780 和 OVCAR-3 的 RPMI;如材料清单中所述补充）.
   注意:细胞浓度取决于细胞类型和实验持续时间;实验结束时不应超过 80%-90% 的汇合细胞生长。
   注意:人类细胞系可能存在生物危害，应采取适当的安全措施进行处理。
4. 将 200 μL 细胞悬液（通常在 200 μL 中加入 5,000-20,000 个细胞，用于 72 小时的实验，取决于倍增时间）作为滴剂放在每个盖玻片的中心，并盖上培养皿盖。
在
5. CO₂ 培养箱中于 37 °C 孵育直至细胞粘附;在此阶段可以过夜孵育。
6. 使用 200 或 1,000 μL 移液器从液滴中吸出液体。
7. 轻轻吸取 2 mL 完全生长培养基以填充每个培养皿。使用无菌吸头移液并轻轻敲击盖玻片边缘，以释放偶尔卡在载玻片下的气泡。
8. 用盖子盖住培养皿，并将其放入 37 °C 的 CO₂ 培养箱中，直到 TTFields 处理开始。

3. TTFields 应用程序

1. 将带有 TTFields 培养皿的底板转移到冷藏的 CO₂ 培养箱中。
   注意:体外 TTFields 应用会产生热量;因此，需要一个冷藏箱来补偿餐具的加热。较高的 TTFields 强度会产生更多的热量，并且需要较低的培养箱环境温度（见表 1）。当用于 TTFields 应用的培养箱温度在 18-30 °C 范围内时，即可达到临床相关的 TTFields 强度。
2. 将扁平电缆母连接器连接到底板。打开 TTFields 发生器。
3. 启动 TTFields 体外应用系统软件并选择实验设置。
   1. 定义新实验。在计算机屏幕上的软件用户界面中键入实验的名称和实验所有者。调整每个培养皿或底板的频率和目标温度。
4. 使用该软件启动 TTFields 应用程序。
5. 确认所有菜肴都已正确连接并在显示器上显示为浅蓝色。如果培养皿被红框圈出（意味着它没有正确连接），请轻轻按下它并缓慢来回旋转，直到触点恢复并且培养皿呈现浅蓝色。
6. 让 TTFields 体外应用系统运行长达 24 小时。
7. 如果实验到达终点，请单击软件中的 END EXPERIMENT 按钮停止实验，然后继续执行步骤 5。如果没有，请单击 PAUSE experiment （暂停实验）。
8. 断开扁平电缆连接器与底板的连接。将装有培养皿的底板从培养箱中取出到层流柜中。
9. 每 24 小时更换一次所有培养皿中的培养基，并将底板放回冷藏培养箱中。使用扁平电缆将底板连接到发电机。单击 CONTINUE 按钮继续实验。

表 1.培养箱环境温度和 TTFields 培养皿内的预期 TTFields 强度。

4. 控制样本

注:在与 TTFields 处理的细胞相似的条件下培养对照细胞，不包括 TTFields 应用。

1. 使用相同的悬浮液和相似表面的板对照样品，用于接种 TTFields 处理的样品。
2. 将对照培养皿置于 37 °C 的 CO₂ 培养箱中。
3. 每 24 小时更换一次培养皿中的培养基，以匹配 TTFields 处理的培养皿培养基条件。

5. 实验结束

1. 单击 END EXPERIMENT 后，等待软件从系统中检索所有记录并将记录保存到计算机。
2. 使用 REPORTS（报告）按钮查看每个底板的温度、电流和电阻日志文件，以验证是否按照实验计划处理了所有培养皿。
   注意:实验结束后，所有报告和日志都会保存到计算机中，并且可以随时查看。
3. 关闭 TTFields 发生器。
4. 断开扁平电缆与底板的连接，然后将其从培养箱中取出。
5. 要取出陶瓷皿，请逆时针向下按压并转动培养皿，将其从底板上解锁。
6. 将培养皿放入层流柜中，并在无菌条件下取下盖玻片。将它们转移到含有新鲜培养基或磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的无菌培养皿中，以进行进一步检查和评估。