确定癌细胞的最佳抑制性肿瘤治疗电场频率：一种评估TTFields对癌细胞活力影响的非侵入性体外方法

摘要

来源：Porat, Y. 等. 利用肿瘤治疗电场（TTFields）确定对癌细胞的最佳抑制频率。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了交变电场（TTField）处理对体外培养的卵巢癌细胞系生长的影响。in vitro 实验可用于确定使癌细胞数量减少达到最大化的最佳电场频率。

方案

1. 电场治疗 体外 应用系统 - 底板与培养皿维护

1. 在流动的自来水下冲洗培养皿及其盖子，然后用去离子水冲洗，并倒置晾干。
2. 若先前实验中在培养皿中添加过化疗药物/试剂，则向每个培养皿中加入5%的轻型洗涤剂溶液，并静置过夜。
   1. 在流动的自来水下彻底冲洗培养皿，以避免皿内残留任何洗涤剂痕迹。再用去离子水冲洗培养皿及其盖子，并倒置晾干。
3. 将洁净且干燥的培养皿连同其盖子放入灭菌袋中，密封后将灭菌袋放入高压灭菌器，培养皿应倒置放置。在不超过121 °C的条件下高压灭菌30分钟。
4. 将高压灭菌器设置为干燥程序，略微打开灭菌器门，对培养皿干燥30分钟。
5. 用70%乙醇略微润湿的布擦拭底板。

2. 实验设置

注意：本方案中使用的所有仪器和材料均在材料清单中列出。以下所有步骤均应在超净工作台内进行，并保持无菌条件。

1. 按照第1节所述准备干净且无菌的TTFields培养皿和盖子。用蘸有70%乙醇的布轻轻擦拭底板。
2. 将TTFields培养皿连同盖子安装到底板上，轻轻按压培养皿并向顺时针方向旋转约5 mm，直至培养皿边缘卡入底板上的三个固定针中。在每个培养皿底部放置一片无菌的22 mm盖玻片（经处理的塑料或玻璃材质）。
3. 使用完全培养基制备细胞悬液（U-87 MG和F98细胞使用DMEM培养基，A2780和OVCAR-3细胞使用RPMI培养基；补充成分详见材料清单）。
   注意：细胞接种浓度取决于细胞类型和实验持续时间；实验结束时细胞融合度不应超过80%–90%。
   警告：人源细胞系可能具有生物危害性，应采取适当的安全防护措施进行操作。
4. 将200 µL细胞悬液（通常为5,000–20,000个细胞/200 µL，具体数量根据细胞倍增时间而定，适用于72小时实验）以液滴形式加至每片盖玻片中央，并用培养皿盖盖好。
5. 将培养皿置于37 °C、含CO₂的培养箱中孵育，直至细胞贴壁；此步骤可过夜孵育。
6. 使用200 µL或1,000 µL移液器吸除液滴中的培养液。
7. 轻柔地加入2 mL完全培养基以充满每个培养皿。使用无菌枪头移液，并轻轻敲击盖玻片边缘，以释放偶尔滞留在玻片下方的气泡。
8. 盖上培养皿盖，将其置于37 °C、含CO₂的培养箱中，直至开始TTFields处理。

3. TTFields 应用

1. 将带有已连接TTFields培养皿的底板转移至带制冷功能的CO₂培养箱中。
   注意：体外应用TTFields会产生热量，因此需要使用制冷培养箱以补偿培养皿的升温。TTFields强度越高，产生的热量越多，所需培养箱环境温度越低（见表1）。当TTFields应用时培养箱温度处于18–30 °C范围内时，可达到临床相关强度。
2. 将扁平电缆的母接头连接到底板上。打开TTFields发生器电源。
3. 启动TTFields 体外应用系统软件，并选择实验设置。
   1. 定义一项新实验。在计算机屏幕上的软件用户界面中输入实验名称和实验负责人。为每个培养皿或底板调节频率和目标温度。
4. 通过软件启动TTFields应用。
5. 确认所有培养皿均已正确连接，并在显示器上显示为浅蓝色。若某个培养皿被红色边框圈出（表示连接异常），请轻轻按压并缓慢来回旋转，直至接触恢复，培养皿显示为浅蓝色。
6. 让TTFields 体外应用系统持续运行最多24小时。
7. 若实验已达到终点，点击软件中的“结束实验”按钮并进入第5步；否则，点击“暂停实验”按钮。
8. 从底板上断开扁平电缆接头。将带培养皿的底板从培养箱中取出，移至超净工作台内。
9. 每24小时更换所有培养皿中的培养基，并将底板放回制冷培养箱中。使用扁平电缆将底板重新连接至发生器。点击“继续”按钮以继续实验。

培养箱环境温度	预期的TTFields强度
(°C)	(V/cm RMS)
18	1.62
19	1.55
20	1.48
21	1.41
22	1.33
23	1.26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0.97
28	0.9
29	0.83
30	0.76

表1. 孵箱环境温度及TTFields培养皿内预期的TTFields强度。

4. 对照样品

注意：对照细胞的培养条件应与接受 TTFields 处理的细胞相似，但不施加 TTFields。

1. 使用与TTFields处理样本相同的悬浮液和类似的表面，接种对照样本。
2. 将对照培养皿置于37 °C的CO₂培养箱中。
3. 每24小时更换一次培养皿中的培养基，以保持与TTFields处理组培养皿相同的培养基条件。

5. 实验结束

1. 单击“结束实验”后，等待软件从系统中检索所有记录，并将记录保存到计算机中。
2. 使用“报告”按钮查看每块基板的温度、电流和电阻日志文件，以确认所有培养皿均按照实验计划进行了处理。
   注意：所有报告和日志均在实验结束后保存至计算机，可随时查阅。
3. 关闭TTFields发生器。
4. 断开扁平电缆与基板的连接，并将其从培养箱中取出。
5. 要取下陶瓷培养皿，请向下按压并逆时针旋转，以将其从基板上解锁。
6. 将培养皿移至超净工作台，无菌条件下取下盖玻片，并转移至含有新鲜培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌培养皿中，用于后续观察和评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体外系统与软件	Novocure	ITG1000 和 IBP1000	每个单元包含 1 台 TTFields 发生器、1 个底板、8 个带盖的 TTFields 培养皿和 1 根扁平电缆。
灭菌袋	Westfield medica	24882
塑料盖玻片	Thermo Scientific (NUNC)	174977	预处理并已灭菌
玻璃盖玻片	Thermo Scientific (Menzel-Gläser)	CB00220RA1	必要时进行灭菌
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基	Biological Industries (以色列)	01-055-1A	使用前在 37 °C 水浴中预热
RPMI 1640	Gibco	21875-034	使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清 (FBS)	Biological Industries (以色列)	04-007-1A	使用前在 37 °C 水浴中预热
L-谷氨酰胺 200 mM (100x)	Gibco	25030-029
青霉素/链霉素溶液 (10,000 U/mL 青霉素, 10,000 µg/mL 链霉素)	Gibco	15140-122
丙酮酸钠溶液 100 mM	Biological Industries (以色列)	03-042-1B
HEPES 缓冲液 1 M	Biological Industries (以色列)	03-025-1B
牛胰腺胰岛素溶液	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	Biological Industries (以色列)	03-050-1B	使用前在 37 °C 水浴中预热
甲醇	Merck	1.06009.2511	使用前在冰箱中冷却至 -20 °C
PBS	Biological Industries (以色列)	02-023-1A	不含钙和镁
A2780	ECACC	93112519	在 RPMI 1640 培养基中培养，添加 FBS (10%)、青霉素/链霉素 (100 U/mL / 100 µg/mL)、丙酮酸钠 (1 mM) 和 HEPES 缓冲液 (12 mM)。
F98	ATCC	CRL-2397	在 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基中培养，添加 FBS (10%)、青霉素/链霉素 (100 U/mL / 100 µg/mL)、丙酮酸钠 (1 mM) 和谷氨酰胺 (2 mM)。
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	在 RPMI 1640 培养基中培养，添加 FBS (20%)、青霉素/链霉素 (100 U/mL / 100 µg/mL)、丙酮酸钠 (1 mM)、HEPES 缓冲液 (12 mM) 和胰岛素 (10 µg/mL)。
U-87 MG	ATCC	HTB-14	在 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基中培养，添加 FBS (10%)、青霉素/链霉素 (100 U/mL / 100 µg/mL)、丙酮酸钠 (1 mM) 和谷氨酰胺 (2 mM)。
带制冷功能的 CO2 培养箱	CARON	7404-10-3
层流洁净工作台	ADS Laminair	Bio12 和 VSM12