卵窗法：一种打开受精鸡卵壳以暴露绒毛尿囊膜血管的方法

摘要

来源：Sharrow, A. C. 等。利用鸡胚尿囊绒毛膜体内模型研究妇科和泌尿系统癌症。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们介绍一种打开受精鸡胚蛋壳的技术，以暴露其携带分支血管网络的绒毛尿囊膜（CAM）。暴露的CAM可用于 在卵内 肿瘤建模

方案

所有涉及鸡胚的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备卵子

1. 在收到鸡蛋之前，按照制造商的说明将孵化箱组装并预热至37.8 °C（100 °F），湿度保持在60-70%。
   注意：为尽量减少污染风险，可使用经高压灭菌的水来控制湿度。
2. 从经认证的实验级蛋品供应商处收到受精的罗得岛红鸡鸡蛋后，用纸巾干擦蛋壳表面。如有必要，可用略微湿润的纸巾去除附着物，随后立即擦干。
   注意：使用低于43.3 °C的液体润湿蛋壳可能将细菌带入蛋内。若需清洗或对鸡蛋进行消毒，液体温度必须控制在43.3-48.9 °C之间。温度过高可能导致蛋内内容物沸腾。消毒剂的选择应基于所关注的微生物种类。
3. 使用铅笔或标记笔在蛋壳上标注日期，此日记为发育第0天。
4. 将鸡蛋放入孵化箱中，持续孵化至少7天，并保持翻转以促进绒毛尿囊膜（CAM）发育。可使用自动翻蛋器，或每日人工翻转180° 2-3次。

2. 开启卵壳

注意：应在绒毛尿囊膜（CAM）完全发育后进行卵壳 opening，通常在发育第7天或第8天进行。

1. 用70%乙醇对生物安全柜进行消毒。同样，用乙醇消毒并将蛋架、照蛋灯、记号笔、装有碳化硅磨石和圆形切割轮的无线旋转工具、18号针头、配四分之一英寸真空管的移液控制器、封箱胶带、普通剪刀、弯头剪刀、Semken（或类似）镊子、棉球以及6 cm × 7 cm透明薄膜敷料放入生物安全柜中。尽可能使用无菌、一次性或经高压灭菌的器械。
2. 关闭蛋旋转器。将大约1–3枚蛋放置于生物安全柜内的蛋架上。在黑暗环境中，将照蛋灯紧贴蛋壳以识别气室位置，并用记号笔标记气室位置。
   注意： 照蛋灯的光照强度对于观察蛋内结构至关重要。如果始终难以看清气室或血管系统，可尝试更换照蛋灯电池。
3. 移动照蛋灯在蛋壳上寻找较大的血管网络。必要时旋转蛋体。理想的血管系统应位于蛋体中部附近并呈分支状。使用记号笔描出拟用于移植的血管系统。
4. 打开生物安全柜的照明灯。使用装有碳化硅磨石的无线旋转工具，在气室正上方的蛋壳中心钻一个小孔。钻孔至大部分蛋壳被去除，但保持白色内膜完整。
   注意： 在定位血管系统前先在气室上方钻孔，有助于确定该枚蛋在气室区域的蛋壳厚度，而非在CAM及血管系统区域的厚度。若CAM或血管系统受损，则该蛋不可用于移植。
5. 在拟打开血管窗的位置，参照气室钻孔方式（步骤2.4），钻开并打开另一个小孔。
6. 使用18号针头，轻轻刺穿气室和血管系统上方的白色内膜。若无法穿透蛋壳，可小心地进一步钻孔。确保白色内膜（但不包括CAM）在整个钻孔区域均被破坏。无需移除内膜碎片。
   注意： 若在此步骤中破坏了CAM或血管系统，则应弃用该蛋。若钻孔处有血液或蛋清渗出，则表明已造成损伤。
7. 关闭生物安全柜的照明灯。使用照蛋灯确认气室已从蛋的一端转移至血管系统上方区域。如有必要，将连接移液控制器的真空管插入原气室上方的孔中，短时轻柔抽吸，以移动气室位置。
8. 使用记号笔在气室–CAM边界内约0.5 cm处标出新气室的轮廓。将一段封箱胶带贴于新气室上方。如有需要，使用普通剪刀将胶带修剪至合适尺寸。
   注意： 胶带可能阻碍蛋壳通气，因此其尺寸不应超过完全覆盖气室所需的最小范围。
9. 将蛋放回培养箱，保持无旋转状态，使新气室朝上以预热。对剩余待打开的蛋重复执行步骤2.2–2.9。
   注意： 本方案可在此暂停。若对CAM发育质量不确定，可先对少量蛋执行至步骤2.16，再决定是否打开其余蛋。
10. 将约1–3枚气室已重定位的蛋放回生物安全柜的蛋架上。
    注意： 应注意避免将污染物引入已打开的蛋中。因此，务必在生物安全柜内打开蛋，并尽可能使用无菌器械和设备。
11. 使用装有圆形切割轮的无线旋转工具，沿步骤2.8中标记的气室边界线切割一小段直线。确保切割线位于实际气室–CAM边界内约0.5 cm处，以避免破坏CAM或血管系统。完全切穿蛋壳，但注意不要深入过深而损伤CAM或血管系统。
12. 使用弯头剪刀沿剩余气室区域剪开，形成蛋壳窗口。
    注意： 若移除的蛋壳碎片上附着血液或膜组织，则该蛋不适合用于移植。若多数蛋未能干净地打开，可考虑至少再等待1天后再打开其余蛋，以促进CAM更好形成。若其余蛋的蛋壳尚未穿刺，应恢复培养箱中蛋的旋转。
13. 验证胚胎的存活状态。存活胚胎应表现出广泛的血管系统、清澈的蛋清、胚胎活动或可见的心跳。
14. 使用Semken镊子从无菌棉球上取下小块棉絮，轻轻擦拭CAM表面，去除蛋壳粉尘和碎屑。
    注意： 去除碎屑操作必须在打开蛋的当天完成。
15. 用一块四分之一大小的6 cm × 7 cm透明薄膜敷料覆盖蛋壳开口。
16. 将蛋放回培养箱。确保蛋体稳固，开口窗朝上，且CAM不接触透明薄膜敷料。可使用蛋架部件、蛋旋转器边缘或其他合适物品支撑易滚动的蛋。
17. 对所有剩余待打开的蛋重复执行步骤2.10–2.16。
    注意： 打开蛋的操作无需与移植操作在同一天完成。至少等待1天有助于淘汰因打开蛋壳而活力受损的胚胎。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Roboz 外科	RS6703		此为示例。任何类似的弯剪均可使用。
Dremel	8050-N/18		该套件包含所有必需工具。
AA Lab Eggs 公司	N/A		需确定本地蛋品供应商，因为该供应商仅在区域内配送。
孵化箱仓库	HB1588D-NONE-1102-1588-1357		可使用其他蛋类孵化箱，但需验证其可靠性。植入后也可使用关闭 CO2 的细胞培养箱。
孵化箱仓库	1102		可使用其他照蛋灯；然而，在我们测试过的设备中，此款为首选。该照蛋灯包含在上述孵化箱套件中。
世界精密仪器公司	15915		此为示例。任何类似的弯头镊子均可使用。本方法已使用多个品牌。
BD	305196		此为示例。任何 18G 针头均可达到类似效果。
精细科学工具公司	11008-13		此为示例。任何类似的镊子或符合研究人员偏好的其他类型均可适用。
电子显微镜科学公司	72914		此为示例。用于拉开蛋壳进行生物发光成像的镊子长度约为 12.8 cm，尖端宽度为 3 mm。
费舍品牌	22-456-885		此为示例。任何无菌棉球均可满足要求。
摩尔医药	21272
康宁	353803		此为示例。可使用任何类似的无菌 10 cm 培养皿。无需组织培养处理。
Tygon	AACUN017		此为示例。任何尺寸相似的管路均可使用。