基于鸡胚尿囊绒毛膜的癌症建模：一种研究癌细胞致瘤性与转移的鸡胚内模型

摘要

来源：Sharrow, A. C. 等. 利用鸡胚尿囊绒毛膜 体内 模型研究妇科和泌尿系统癌症。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们描述了将癌细胞植入鸡绒毛尿囊膜以生成肿瘤异种移植模型的方法 在 卵 模型成功地将卵巢癌细胞移植到模型中，用于研究妇科癌症的进展。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备用于移植的癌细胞悬液（选项1）

注意：此步骤应在移植前立即完成，移植最好在第7至第10天之间进行。有关移植日期的更多信息，请参见步骤3或步骤4开头的说明。该方法适用于所有细胞系以及培养的肾癌肿瘤组织消化液。

1. 将细胞外基质溶液置于冰上解冻。
2. 采用机械和/或酶消化方法，根据拟移植细胞类型的特性选择合适的方法制备单细胞悬液。
3. 将拟移植的全部细胞重悬于适合移植的培养基中。通常每枚鸡胚移植 1–2 × 10⁶ 个细胞。
   注意： 移植细胞系时通常使用该细胞培养所用的完全培养基，其中含有胎牛血清（FBS）或血清替代物。移植肿瘤组织消化物时，通常使用同类型癌症细胞系培养所用的完全培养基。但可根据实验需要对培养基成分进行调整，其对肿瘤发育和生长的影响需通过实验确定。
4. 根据所用细胞类型选择适当的离心速度和时间进行离心，使细胞沉淀。通常离心速度为 250–300 × g，时间为 5–10 分钟。
5. 用移液器吸除细胞沉淀中的上清液。通过轻弹管壁或吹打，将细胞在残留的少量培养基中重新悬浮。置于冰上冷却。使用适当规格的移液器测量细胞与培养基的总体积。
6. 计算移植体积，使每枚鸡胚接种 1–2 × 10⁶ 个细胞，接种体积为 20–100 μL，终浓度为 2.7–4 mg/mL 蛋白的细胞外基质。根据计算结果加入培养基、所需生长因子或其他添加剂以及细胞外基质溶液。配制完成后置于冰上，待移植时使用。
   注意： 在步骤 1.3 和 1.6 的计算中，应额外增加至少半枚鸡胚接种量的体积，以确保整组鸡胚均有足够的接种液。在移植卵巢癌细胞系（如 SKOV3 和 ID8）时，每枚鸡胚接种 10⁶ 个细胞；在移植肾细胞癌细胞系 RENCA、来源于原发性人肾细胞癌消化物的培养细胞、前列腺癌细胞系（如 CWR、C4-2 和 MyC-CaP）以及膀胱癌细胞系（如 HT-1376 和 T24）时，每枚鸡胚接种 2 × 10⁶ 个细胞。

2. 准备用于移植的肿瘤组织块（方案2）

注意： 此步骤应在移植前立即完成，移植最好在第7至第10天之间进行。有关移植日期的更多信息，请参见步骤3或步骤4开头的说明。原发性卵巢癌和膀胱癌以肿瘤组织块的形式进行移植。

1. 将细胞外基质溶液在冰上解冻。用含有所需生长因子或添加剂的适当培养基稀释至终蛋白浓度为 2.7–4 mg/mL。保持在冰上。
   注意：移植肿瘤组织块通常使用同种癌症类型细胞系培养所用的完全培养基。然而，可根据实验需要对培养基成分进行调整。其对肿瘤移植和生长的影响需通过实验经验性确定。
2. 使用手术刀或剪刀从新鲜肿瘤中切取组织块。理想大小为每边 2–5 mm。在准备移植前，保持组织块浸没于培养基中。

3. 使用防粘环进行移植（选项1）

注意：如果绒毛尿囊膜（CAM）已完全发育，可在发育第7天开始植入细胞。只要能为肿瘤生长和所需实验提供充足时间，植入可在孵化前的任何时间进行，但需注意胚胎的免疫细胞大约在受精后第10天开始出现。肿瘤生长速度因细胞类型而异，需针对感兴趣的细胞类型通过实验经验确定。卵巢癌和前列腺癌细胞采用防粘连环法进行植入。请注意，若无防粘连环，可将移液器吸头剪裁至相似尺寸后替代使用。

1. 使用 70% 乙醇对生物安全柜及所有所需工具进行消毒：蛋架、弯头虹膜镊、防粘环（内径 1/4 英寸）、玻璃搅拌棒、适当体积的移液器及吸头、6 × 7 cm 透明薄膜敷料、办公剪刀以及记号笔或铅笔。应尽可能使用无菌、一次性或经高压灭菌的工具。
2. 将待接种的鸡蛋置于生物安全柜内的蛋架上。选择适量的鸡蛋，通常最多六枚。操作过程中应避免鸡蛋过度冷却。
3. 通过将透明薄膜敷料边缘向开口窗方向滚动的方式将其从蛋壳上移除，以避免撕下蛋壳碎片。检查鸡蛋是否存活且健康。理想的鸡蛋在开口区域中央应有一条主血管，周围有较小的分支血管。
4. 使用弯头虹游戏副本，将一个无菌防粘环放置在主血管或其分支点上方的绒毛尿囊膜（CAM）上。用无菌玻璃搅拌棒轻轻刮擦绒毛尿囊膜。
5. 将步骤 1.6 中制备的细胞悬液通过移液加入防粘环中心。或者，使用镊子将步骤 2.2 中获得的肿瘤组织块置于防粘环中心，并覆盖 20–50 μL 步骤 2.1 中制备的细胞外基质溶液。
6. 用 6 × 7 cm 透明薄膜敷料的四分之一片密封开口。用适当的植入编号标记鸡蛋。
   注意：对一组内的鸡蛋进行编号有助于纵向观察。
7. 将鸡蛋放回培养箱。确保蛋壳开口朝上且鸡蛋放置稳固。
   注意：鸡蛋可放回孵化箱而不进行翻转。或者，也可使用 37–38 °C 的细胞培养箱（CO₂ 功能关闭），并使用湿度计监测湿度（应维持在 50%–80%），以获得较高的植入后存活率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
010 聚四氟乙烯（PTFE）白色 55 邵氏 D 硬度 O 型圈	The O-Ring Store	TEF010	用于细胞接种的不粘环。内径 1/4"，外径 3/8"，截面直径 1/16"，材质为聚四氟乙烯（PTFE）。
精细手术剪；弯型；尖-尖刃；30 mm 刀刃长度；总长 4-3/4 英寸	Roboz Surgical	RS6703	此处仅作为示例提供。任何类似的弯剪均可使用。
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max 工具套装	Dremel	8050-N/18	该套装包含所有必要工具
受精鸡卵（罗得岛红羽 - 棕色，实验级）	AA Lab Eggs Inc.	N/A	需寻找本地蛋品供应商，因该供应商仅在特定区域配送。
Hovabator Genesis 1588 Deluxe 孵化器组合套装	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	可使用其他类型的卵孵化器，但其可靠性需经验证。植入后也可使用关闭 CO₂ 功能的细胞培养箱。
Incu-Bright 冷光源检卵灯	Incubator Warehouse	1102	可使用其他检卵灯，但经我们测试，此款为首选。该检卵灯已包含在上述孵化器套件中。
Matrigel 基底膜基质 HC；无 LDEV	Corning	354248	细胞外基质溶液
SKOV3	ATCC	HTB-77	人卵巢癌细胞系。
带橡胶刮头的搅拌棒；直径 5 mm，长度 6 英寸	United Scientific Supplies	GRPL06	此处仅作为示例提供。任何类似的玻璃搅拌棒均可使用。
标本镊	Electron Microscopy Sciences	72914	此处仅作为示例提供。用于在生物发光成像时掀开蛋壳的镊子长度约为 12.8 cm，尖端宽度为 3 mm。