琼脂糖离心沉降法：一种用于类器官组织学分析的包埋技术

摘要

来源：Lee, S. 等. 源自前列腺癌骨转移患者样本及其异种移植瘤的三维（3D）类器官的建立与分析。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们通过离心沉降实验将三维前列腺癌类器官包埋于琼脂糖中。这些包埋的类器官可用于进一步的组织病理学分析，以研究癌症的生长与发育过程。

方案

1. 类器官组织学处理：琼脂糖离心沉淀法

注意： 本方案改编自 Vlachogiannis 之前发表的研究 等 我们增加了一个琼脂糖包埋步骤，以成功包埋所有类器官群体。

1. 移除孔板中的原有培养基。注意不要吸走基底膜穹顶结构。
2. 加入与步骤1中移除体积相等的细胞回收溶液，并在4 °C下孵育60分钟。
3. 使用移液器将基底膜穹顶从孔板表面移下，并用移液器吸头压碎该结构。收集解离后的穹顶和细胞回收溶液至1.5 mL离心管中。
4. 在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。
5. 移除上清液（细胞回收溶液）。将所有上清液分别保存在独立的离心管中，直至最终离心步骤确认类器官的存在后再行处理。
6. 加入所需体积的冷PBS（表1），并轻轻吹打混匀，以机械方式分散沉淀。
7. 在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。
8. 移除上清液（PBS）。
9. 用等体积（例如，24孔板培养条件下一个沉淀对应500 µL，表1）的4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定沉淀60分钟。
10. 固定完成后，在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。
11. 移除上清液（PFA）。
12. 用等体积（例如，24孔板培养条件下一个沉淀对应500 µL，表1）的PBS洗涤，并在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。
13. 制备温热的琼脂糖溶液（PBS中含2%琼脂糖）。
    注意：此处，用于冷冻切片的细胞沉淀可直接重悬于200 µL OCT包埋剂中。
14. 将细胞沉淀重悬于200 µL琼脂糖溶液（PBS中含2%琼脂糖）中。
    1. 加入琼脂糖后应立即使用连接1 mL注射器的25 G针头轻轻将细胞沉淀从1.5 mL离心管管壁上剥离。如图1所示，若细胞沉淀未从管壁上物理分离，则在琼脂糖包埋过程中可能丢失全部或部分细胞沉淀。
15. 等待PBS中的2%琼脂糖完全凝固。
16. 使用连接1 mL注射器的25 G针头将凝固的琼脂糖块从1.5 mL离心管中分离出来。
17. 将含有细胞沉淀的琼脂糖块转移至新的1.5 mL离心管中。
18. 向管中加入70%乙醇（EtOH），并按照常规组织脱水与石蜡包埋流程继续操作。

表1：每个基质胶微滴所需的接种密度、基底膜体积和培养基体积

培养板	接种密度（细胞数）	基底膜基质体积（μL）	培养基（μL）
48 孔板	25,000–50,000	20	250
24 孔板	50,000–250,000	40	500
6 孔板	50,000–250,000	40	2,000

结果

图1：成功进行琼脂糖包埋的关键步骤。 一种将细胞沉淀从1.5 mL离心管管壁上脱离的操作流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 移液器	Gilson	F123602
1 mL 注射器	BD 注射器	329654
1.5 mL 离心管	Spectrum Lab Products	941-11326-ATP083
25G 针头	BD PrecisionGlide 针头	305122
4% 多聚甲醛（PFA）	Alfa Aesar	J61899
70% 乙醇（EtOH）	VWR	BDH1164-4LP
琼脂糖	Lonza	50000
细胞培养板 - 24 孔	Costar	3524
细胞培养板 - 48 孔	Costar	3548
细胞培养板 - 6 孔	Costar	3516
细胞解离液，Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
细胞回收溶液	Corning	354253
细胞刮刀	Sarstedt	83.18
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
适用于 1 mL 移液器的吸头（蓝色吸头）	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
小型台式离心机	ThermoFisher Scientific	75002426
OCT 包埋剂	Tissue-Tek	4583
水浴锅	Fisher Sc	2320