琼脂糖离心下降测定:一种嵌入类器官进行组织学分析的技术

1. 用于组织学的类器官加工:琼脂糖离心下降法

注意:该协议改编自 Vlachogiannis 等人之前的出版物。我们添加了一个涉及琼脂糖包埋的步骤，以成功包埋所有类器官种群。

1. 从孔中取出现有介质。小心不要吸出基底膜圆顶。
2. 加入等体积（等于从步骤 1 中去除的培养基体积）的细胞回收溶液，并在 4 °C 下孵育 60 分钟。
3. 用移液管移开基底膜圆顶，然后用移液管吸头压碎基底膜圆顶。将解离的圆顶和细胞回收溶液收集在 1.5 mL 试管中。
4. 在 300 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。
5. 去除上清液（细胞回收溶液）。将所有上清液保存在单独的试管中，直到最后在沉淀步骤中确认类器官的存在。
6. 加入所需体积（表 1）的冷 PBS，轻轻上下移液以机械干扰沉淀。
7. 在 300 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。
8. 去除上清液 （PBS）。
在
9. 室温下将沉淀固定在 4% PFA 的匹配体积中（例如，来自 24 孔板培养条件的一个沉淀为 500 μL，表 1）60 分钟。
10. 固定后，在 300 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。
11. 去除上清液 （PFA）。
12. 用匹配体积的 PBS（例如，来自 24 孔板培养条件的一个沉淀 500 μL，表 1）洗涤，并在 300 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。
13. 准备温热的琼脂糖（PBS中的2%琼脂糖><）。 注意: 在这里，用于冷冻切片的细胞沉淀可以直接重悬于 200 μL OCT 化合物中。
将
14. 细胞沉淀重悬于 200 μL 琼脂糖（2% PBS 溶液）中。
    1. 加入琼脂糖后，立即使用连接到 1 mL 注射器的 25 G 针头将细胞沉淀从 1.5 mL 管壁上轻轻分离。如图 1 所示，如果细胞沉淀没有从 1.5 mL 试管壁上物理分离，则在琼脂糖包埋过程中存在全部或部分细胞沉淀丢失的风险。
15. 等到 PBS 中的 2% 琼脂糖完全凝固。
16. 使用连接到 1 mL 注射器的 25 G 针头从 1.5 mL 试管中分离固化的琼脂糖块。
17. 将含有细胞沉淀的分离琼脂糖块转移到新的 1.5 mL 试管中。
18. 用 70% EtOH 填充试管，并使用常规方案进一步进行组织脱水和石蜡包埋。

表 1:一个圆顶所需的接种密度、基底膜体积和介质体积

图 1:琼脂糖成功包埋的关键步骤。将细胞沉淀从 1.5 mL 试管壁上分离的过程。