Protein Lysate Extraction: A Technique to Lyse Organoids to Collect Cellular Proteins

doi:10.3791/30035

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

蛋白质裂解物提取:一种裂解类器官以收集细胞蛋白质的技术

July 8, 2025

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Abstract Protocol Disclosures Materials Reprints and Permissions

Abstract

来源:Crowell， PD 等人使用类器官培养评估小鼠前列腺上皮细胞的分化能力。J. Vis. Exp. （2019 年）

在本视频中，我们演示了从基底膜基质环中培养的前列腺类器官中提取蛋白质裂解物。分析提取的蛋白质组分有助于研究类器官中的谱系标记物表达。

Protocol

1. 从前列腺类器官中提取蛋白质裂解物用于蛋白质印迹分析 — 时间:2.5-4 小时

注意:在收集类器官用于蛋白质裂解物提取之前，准备并预热含分散酶的培养基（表 1）。

将 24 孔板倾斜 45° 角，并使用 P1000 移液器从每个孔的中心轻轻去除现有培养基，同时避开基质凝胶环，从每个孔中取出培养基。
要收集类器官，将 1 mL 含分散酶的培养基直接移液到基质凝胶环上，直到整个环脱落，然后转移到 1.5 mL 微量离心管中，重复喷射基质凝胶。
注意:避免直接接触 Poly-HEMA 包被的孔至关重要。直接接触可能会导致收集的材料被 Poly-HEMA 污染，这可能会对细胞存活产生负面影响。
将 1.5 mL 微量离心管放入 37 °C 5% CO₂ 培养箱中 30 分钟至 1 小时，以分散酶完全消化基质凝胶。
通过在 RT 下以 800 x g 离心 5 分钟沉淀类器官，并使用微量移液管去除上清液。
将磷酸盐缓冲盐水（PBS）添加到类器官沉淀中，然后轻轻轻弹重悬。
注:未能充分重悬类器官沉淀可能会导致类器官材料被残留的分散酶或基质凝胶污染。
通过在室温下以 800 x g 离心 5 分钟来沉淀类器官，并使用微量移液器去除上清液。
通过将每根试管放入含有干冰和甲醇的溶液中来快速冷冻类器官沉淀。将试管储存在 -80 °C 下以备将来使用。或者，在步骤 1.6 后立即提取蛋白质裂解物。
将类器官沉淀重悬于每 10 μL 填充细胞体积的 100 μL 蛋白质裂解缓冲液（表 1）中。轻拂以重新挂起。
注:如果在快速冷冻后恢复，请确保在 -80 °C 下取样品之前解冻蛋白质裂解缓冲液，因为必须立即将裂解缓冲液添加到样品中以防止磷酸酶和蛋白酶活性。
将样品在冰上的蛋白质裂解缓冲液中孵育至少 45 分钟。
注:建议在冰上孵育前进行超声处理，以提高核蛋白回收的效率;但是，不需要超声处理。如果未执行超声处理，请继续执行步骤 1.10。
1. 超声处理时，将试管浸入湿冰中，然后将声波分离器的尖端轻轻地贴在微量离心管上。在 20 kHz 下超声处理 40 秒。
按照既定方案进行 Western 印迹。

表 1:关键溶液的制备说明

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 食谱含分散酶的培养基晚期 DMEM F12 中的 1 mg/mL 分散酶 + 10 μM ROCK 抑制剂。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。解离培养基 RPMI 1640 中的 10% FBS + 1x 青霉素-链霉素。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。蛋白裂解缓冲液 RIPA 缓冲液 + 磷酸酶抑制剂 + 蛋白酶抑制剂阻塞解决方案 PBS 中的 10% FBS 和 0.2% Triton X-100

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 编号 A83-01 托克里斯 2939 元高级 DMEM/F-12 赛默飞世尔科技 12634010 B-27 添加剂（50x），无血清赛默飞世尔科技 17504044 Dispase II，粉末赛默飞世尔科技编号:17-105-041 胎牛血清（FBS）西格马 F8667 GlutaMAX Thermo 系列 Fisher Scientific 公司 35050061 Halt 磷酸酶抑制剂赛默飞世尔科技 78428 Matrigel GFR 膜基质康宁 CB- 40230C 型 N-乙酰基-L-半胱氨酸西格马编号 A9165 正常霉素赛默飞世尔科技蚂蚁-NR-1 青霉素-链霉素（10,000 U/
毫升）赛默飞世尔科技邮编:15-140-122 聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）
（Poly-HEMA）西格马 P3932-25G 放射免疫沉淀测定
（英国皇家建筑师协会）赛默飞世尔科技 PI89901 重组人 EGF，无动物成分百科科技 AF-100-15 重组人 Noggin 百科科技 120-10C RPMI 1640 培养基，HEPES （cs of
10）赛默飞世尔科技 22400105 声波干扰器赛默飞世尔科技 FB120 系列海卫一 X-100 西格马 X100-5 毫升 Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂） Selleck 化工 S1049-50毫克

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video