蛋白裂解物提取：一种裂解类器官以收集细胞蛋白的技术

摘要

来源：Crowell, P. D. 等 利用类器官培养评估小鼠前列腺上皮细胞的分化能力。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了从培养于基底膜基质环中的前列腺类器官提取蛋白裂解液的方法。对提取的蛋白组分进行分析，有助于研究类器官中谱系标志物的表达情况。

方案

1. 从前列腺类器官中提取蛋白裂解液用于Western印迹分析 — 所需时间：2.5–4 小时

注意： 在收集类器官用于蛋白裂解液提取之前，需准备并预热含dispase的培养基（表 1）。

1. 将24孔板倾斜45°角，使用P1000移液器从每个孔的中心轻轻吸出培养基，避免触碰基质胶环，从而去除各孔中的培养基。
2. 用移液器将含有dispase的培养基直接反复吹打基质胶，每次1 mL，直至整个基质胶环脱落，收集类器官并转移至1.5 mL微量离心管中。 
   注意： 必须避免直接接触涂有Poly-HEMA的孔壁。直接接触可能导致收集的材料被Poly-HEMA污染，从而对细胞存活产生不利影响。
3. 将1.5 mL微量离心管放入37 °C、5% CO₂培养箱中₂ 在孵育箱中孵育30分钟至1小时，使dispase充分消化基质凝胶。
4. 通过800 x g离心沉淀类器官 g 在室温下孵育5分钟，然后使用微量移液器吸除上清液。
5. 向类器官沉淀中加入磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻弹击混匀。 
   注意： 未充分重悬类器官沉淀物可能导致类器官材料被残留的分散酶或基质胶污染。
6. 通过800 x g离心使类器官沉淀 g 室温下离心5分钟，用微量移液器吸除上清液。
7. 将含有类器官的离心管置于干冰与甲醇混合液中进行快速冷冻。随后将离心管于-80 °C保存，以备后续使用。或者，可在步骤1.6之后立即提取蛋白裂解液。
8. 将类器官沉淀重悬于 100 µL 蛋白裂解缓冲液中（表1每10 µL压积细胞体积加入适量试剂，轻轻振荡重悬。 
   注意： 若在快速冷冻后恢复实验，需在将样品从 -80 °C 取出前确保蛋白裂解缓冲液已解冻，因为必须立即将裂解缓冲液加入样品中，以防止磷酸酶和蛋白酶活性。
9. 将样品置于冰上，在蛋白裂解缓冲液中孵育至少45分钟。 
   注意： 建议在冰上孵育前进行超声处理，以提高核蛋白回收效率；但超声处理并非必需。如果不行超声处理，则直接进行步骤1.10。
   1. 进行超声处理时，将离心管浸入湿冰中，并将超声破碎仪的探头轻轻接触微型离心管。在20 kHz条件下超声处理40秒。
10. 按照既定方案进行蛋白质印迹实验。

表1：关键溶液配制说明

配方
含 Dispase 的培养基	在高级 DMEM F12 培养基中加入 1 mg/mL Dispase 和 10 µM ROCK 抑制剂。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。
解离培养基	在 RPMI 1640 培养基中加入 10% FBS 和 1× 青霉素-链霉素。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。
蛋白裂解缓冲液	RIPA 缓冲液 + 磷酸酶抑制剂 + 蛋白酶抑制剂
封闭液	含 0.2% Triton X-100 的 PBS 中加入 10% FBS

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A83-01	Tocris	2939
高级DMEM/F-12培养基	赛默飞世尔科技	12634010
B-27添加剂（50倍浓度），无血清	赛默飞世尔科技	17504044
Dispase II，粉末	赛默飞世尔科技	17-105-041
胎牛血清（FBS）	Sigma	F8667
GlutaMAX	赛默飞世尔科技	35050061
Halt磷酸酶抑制剂	赛默飞世尔科技	78428
Matrigel GFR基底膜基质	Corning CB-	40230C
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A9165
Normocin	赛默飞世尔科技	ant-nr-1
青霉素-链霉素 （10,000 U/ mL）	赛默飞世尔科技	15-140-122
聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯） （Poly-HEMA）	Sigma	P3932-25G
放射免疫沉淀分析裂解液 （RIPA）	赛默飞世尔科技	PI89901
重组人表皮生长因子（EGF），无动物成分	PeproTech	AF-100-15
重组人Noggin蛋白	PeproTech	120-10C
RPMI 1640培养基，含HEPES（浓度为 10）	赛默飞世尔科技	22400105
超声破碎仪	赛默飞世尔科技	FB120
Triton X-100	Sigma	X100-5ML
Y-27632二盐酸盐（ROCK抑制剂）	Selleck Chemical	S1049-50MG