完整组织免疫荧光成像：一种用于评估完整类器官的固定与染色技术

摘要

来源：Crowell, P. D. 等. 利用类器官培养评估小鼠前列腺上皮细胞的分化能力. 视频期刊 (2019)

本视频介绍了对完整的前列腺癌类器官进行免疫荧光染色，并通过整体封片共聚焦显微镜成像的技术。该技术旨在评估基底细胞和腔内前列腺上皮细胞的体外分化能力。

方案

1. 前列腺类器官的固定与染色用于全-mount 共聚焦显微镜免疫组织化学分析

1. 从24孔板中收集前列腺类器官 — 所需时间：45–60 分钟
   注意：在收集用于共聚焦显微镜检测的前列腺类器官时，必须小心操作以维持其结构完整性。以下收集方案旨在减少类器官在分离过程中结构的破坏。
   1. 将含有类器官的培养板倾斜45°角，吸出各孔中的培养基。
   2. 加入500 µL含dispase的培养基（表1），在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟，以消化基质胶。
   3. 将消化后的类器官悬液转移至微量离心管中，于室温下以800 × g离心3分钟收集类器官沉淀，弃去上清液。
2. 前列腺类器官整体免疫荧光染色 — 所需时间：3–4天（每天1–5小时）
   1. 加入500 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下轻轻振荡孵育2小时。
   2. 于室温下以800 × g离心3分钟收集类器官沉淀，弃去上清液，加入1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。
   3. 参照步骤1.2.2的方法再洗涤两次。
   4. 于室温下以800 × g离心3分钟收集类器官沉淀，弃去上清液。加入含1 µg/mL DAPI的封闭液（表1），在室温下孵育2小时，或在4 °C下避光孵育过夜，同时轻轻振荡。
   5. 于室温下以800 × g离心3分钟收集类器官沉淀，弃去上清液。加入用封闭液稀释的一抗（兔抗p63、小鼠抗细胞角蛋白8），在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。
   6. 于室温下以800 × g离心3分钟收集类器官沉淀，弃去上清液。加入1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。
   7. 参照步骤1.2.6的方法再洗涤两次。
   8. 于室温下以800 × g离心3分钟收集类器官沉淀，弃去上清液。加入用封闭液稀释的二抗（Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG），在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。
   9. 于室温下以800 × g离心3分钟收集类器官沉淀，弃去上清液，加入1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。
   10. 参照步骤1.2.9的方法再洗涤两次。

2. 前列腺类器官染色后组织透明化及全-mount共聚焦显微镜观察的制样 — 耗时：7 小时

1. 在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，沉淀类器官，并移除上清液。
2. 加入 1 mL 含 1% Triton X-100 的 PBS 配制的 30% 蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时。
3. 在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，沉淀类器官，并移除上清液。
4. 加入 1 mL 含 1% Triton X-100 的 PBS 配制的 45% 蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时。
5. 在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，沉淀类器官，并移除上清液。
6. 加入 1 mL 含 1% Triton X-100 的 PBS 配制的 60% 蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时。
7. 在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，沉淀类器官，并移除 95% 的上清液。
   注意：随着蔗糖浓度升高，沉淀物会变得松散。建议在紫外光下观察经 DAPI 染色的类器官，以确认其在移除上清液过程中未丢失。
8. 将剩余悬液中的 10–20 µL 液滴转移至带腔室的盖玻片，进行共聚焦显微镜观察。
   注意：可在液滴两侧放置盖玻片碎片作为间隔物（图 1C），以防止盖玻片覆盖液滴时压碎类器官。

表1：关键溶液配制说明

组分	浓度
B-27	1x（从50x浓缩液稀释）
GlutaMAX	1x（从100x浓缩液稀释）
N-乙酰-L-半胱氨酸	1.25 mM
Normocin	50 µg/mL
重组人EGF（无动物源性）	50 ng/mL
重组人Noggin	100 ng/mL
R-spondin 1-条件培养基	10% 条件培养基
A83-01	200 nM
DHT	1 nM
Y-27632 二盐酸盐（ROCK抑制剂）	10 µM
Advanced DMEM/F-12	基础培养基
R-spondin 1-条件培养基的制备方法见Drost等人的描述。加入所有组分后，使用0.22 µm滤器对小鼠类器官培养基进行过滤除菌。ROCK抑制剂仅在类器官培养建立及传代过程中添加。

结果

图 1：通过蛋白质印迹法和整体共聚焦显微镜分析前列腺类器官中谱系标志物的表达。 （A）培养 7 天后，基底细胞来源（上图）和腔面细胞来源（下图）类器官的代表性相差显微图像。比例尺 = 100 µm。（B）培养 5 天后，基底细胞来源（Bas）和腔面细胞来源（Lum）类器官的蛋白质印迹分析。检测基底细胞标志物细胞角蛋白 5（K5）、腔面细胞标志物细胞角蛋白 8（K8）以及上样对照组组蛋白 H3（HH3）。（C）带隔片的腔室盖玻片示意图。（D）培养 7 天后，基底细胞来源（上图）和腔面细胞来源（下图）类器官的代表性微分干涉差（DI...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛  	Thermo Fisher Scientific	50-980-487
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） 	Thermo Fisher Scientific	 D1306
高级DMEM/F-12培养基  	Thermo Fisher Scientific	12634010
Dispase II，粉末  	Thermo Fisher Scientific	17-105-041
胎牛血清（FBS）  	Sigma	F8667
山羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488  	Invitrogen	A28175
山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 594 	 Invitrogen	A11012
小鼠抗细胞角蛋白8单克隆抗体  	BioLegend	904804
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）  	Thermo Fisher Scientific	15-140-122
兔抗p63抗体 	BioLegend	619002
RPMI 1640 培养基，含HEPES（浓度为10） 	Thermo Fisher Scientific	22400105
蔗糖  	Sigma	S0389-500G
Triton X-100	 Sigma	 X100-5ML