整体免疫荧光成像:一种评估完整类器官的固定和染色技术

1. 通过整体共聚焦显微镜固定和染色用于免疫组织化学分析的前列腺类器官

1. 从 24 孔板中收集前列腺类器官 — 时间:45-60 分钟
   注意:在收集前列腺类器官进行共聚焦显微镜检查时，小心处理它们以保持其结构至关重要。以下收集方案旨在减少分离过程中类器官结构的破坏。
   1. 将板倾斜 45° 角，从含有类器官的板的每个孔中去除培养基。
   通过在
   2. 37 °C 5% CO₂ 培养箱中将基质凝胶与 500 μL 含分散酶的培养基（表 1）孵育 30 分钟来消化基质凝胶。
   3. 将消化的类器官悬浮液收集在微量离心管中，并在室温下以 800 x g 离心 3 分钟使类器官沉淀。去除上清液。
2. 前列腺类器官的整装免疫荧光染色 — 时间:3-4 天（1-5 小时/天）
   1. 在 PBS 中加入 500 μL 4% 多聚甲醛，并在 RT 下轻轻摇动孵育 2 小时。
   2. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，去除上清液，然后用 1 mL PBS 洗涤沉淀 15 分钟，轻轻摇动。
   3. 按照步骤 1.2.2 中再洗涤沉淀两次。
   4. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，并去除上清液。在封闭溶液中加入 1 μg/mL DAPI（表 1）。在 RT 下孵育 2 小时，或在 4 °C 下轻轻摇
   动过夜。
   5. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，并去除上清液。在封闭溶液中加入一抗（兔抗 p63，小鼠抗细胞角蛋白 8），并在 4 °C 下轻轻摇动孵育过夜。
   6. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，并去除上清液。用 1 mL PBS 洗涤沉淀 15 分钟，轻轻摇动。
   7. 按照步骤 1.2.6 中再洗涤沉淀两次。
   8. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，并去除上清液。在封闭溶液中加入二抗（山羊抗兔 IgG-Alexa Fluor 594、山羊抗小鼠 IgG-Alexa Fluor 488），并在 4 °C 下轻轻摇动孵育过夜。
   9. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，去除上清液，然后用 1 mL PBS 洗涤沉淀 15 分钟，轻轻摇动。
   10. 按照步骤 1.2.9 中洗涤沉淀物 2 次。

2. 用于整体共聚焦显微镜的染色前列腺类器官的组织透明化和封片 — 时间:7 小时

1. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，并去除上清液。
2. 在含 1% Triton X-100 的 PBS 中加入 1 mL 30% 蔗糖，并在 RT 下轻轻摇动孵育 2 小时。
3. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，并去除上清液。
4. 在含 1% Triton X-100 的 PBS 中加入 1 mL 45% 蔗糖，并在 RT 下轻轻摇动孵育 2 小时。
5. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟来沉淀类器官，并去除上清液。
6. 加入 1 mL 含 1% Triton X-100 的 PBS 中 60% 蔗糖，并在 RT 下轻轻摇动孵育 2 小时。
7. 通过在 RT 下以 800 x g 离心 3 分钟沉淀类器官，并去除 95% 的上清液。
   注意:随着蔗糖浓度的升高，沉淀变得更松散。建议在紫外光下观察 DAPI 染色的类器官，以确认它们在去除上清液期间没有丢失。
8. 将剩余悬浮液的 10-20 μL 液滴转移到带腔室的盖玻片中，然后进行共聚焦显微镜检查。
   注意:盖玻片碎片可以放置在液滴的任一侧，用作垫片（图 1C）。这些可以防止在将盖玻片放在液滴上时类器官塌陷。

表 1:关键溶液的制备说明

图 1:通过 Western blot 和整体共聚焦显微镜分析前列腺类器官中的谱系标志物表达。（A） 培养 7 天后基底来源（上）和管腔来源（下）类器官的代表性相差图像。比例尺 = 100 μm。（B） 培养 5 天后基底来源 （Bas） 和管腔来源 （Lum） 类器官的蛋白质印迹分析。基础标志物细胞角蛋白 5 （K5） 和管腔标志物细胞角蛋白 8 （K8） 以及上样对照组蛋白 H3 （HH3） 的染色。（C） 带垫片的腔室盖玻片示意图。（D） 培养 7 天后基底来源（上）和管腔来源（下）类器官的代表性微分干涉对比 （DIC） 和免疫荧光图像。p63（红色）、K8（绿色）和 DAPI（蓝色）单独染色并合并。比例尺 = 100 μm。