功能化线材基靶向细胞分离：一种从加标外周血中分离癌细胞的离体技术

摘要

来源：Chen S. 等. 靶细胞预富集与单细胞全基因组扩增用于后续单细胞表征。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了从外周血样本中分离表达 EpCAM 的上皮癌细胞。该技术采用经 EpCAM 抗体功能化的医用级金属丝来捕获目标细胞。随后将捕获的细胞洗脱至缓冲液中。

方案

注意：本方案描述了从 PBS 或 HT-29 细胞与外周血的人工混合物中分离 HT-29 细胞（人结肠癌细胞系）的方法。该实验同样在另外两种细胞系（LNCaP 和 VCaP）上进行，理论上适用于所有表达 EpCAM 的细胞。

1. 靶细胞的制备

1. 细胞培养与细胞标记
   注意： 在本实验方案中，细胞在75 cm²培养瓶中进行培养。若使用其他细胞培养装置（例如, 25 cm² 培养皿、6 孔板等。所有使用的液体均在水浴中预热至 37 °C。除非另有说明，所有操作步骤均在室温（RT）下进行。
   1. 在37 °C、5% CO₂条件下，使用添加了2 mM L-谷氨酰胺、20 mM Hepes、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的McCoy's 5a改良培养基培养HT-29细胞₂ 大气
   2. 当细胞融合度达到90%时，移除培养基，并用10 mL 1x PBS冲洗细胞。
   3. 为收集细胞，加入2 mL细胞解离溶液（材料与试剂表将细胞在37 °C下孵育约5分钟。
      注意： 解离液含有蛋白酶和胶原酶，溶于1×PBS，含0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和3 mg/L酚红。应尽量缩短细胞解离液的预热时间，因其在37 °C下1小时后即失活。覆盖整个细胞层以实现最佳的细胞解离效果。
   4. 使用倒置显微镜检查细胞的脱落情况。
   5. 将所有脱落的细胞转移至一个预先加入10 mL细胞培养基（与步骤1.1.1中使用的相同）的50 mL离心管中，通过移液吹打重悬细胞。
   6. 将剩余的细胞悬液置于室温下的水平滚轴混合器上，随后进行标记步骤。
2. 活细胞标记靶细胞
   1. 将1 µL 5 mM CFSE（溶于二甲基亚砜，DMSO）加入1 mL预热至37 °C的1×PBS中，配制成5 µM的CFSE标记工作液。
      注意： 为获得最佳染色效果，请使用 freshly prepared 溶液。
   2. 配制即用型DNA染色液（材料与试剂表) 在1×PBS中保存，并于2-6 °C避光储存。
      注意： 为获得最佳染色效果，请使用新鲜配制的溶液。
   3. 从水平滚轴混匀器中取出细胞（步骤 1.1.6），在 300 x g 条件下离心收集细胞 g 孵育10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于10 mL 1×PBS中。
   4. 用1×PBS再次洗涤细胞，然后将细胞沉淀重悬于500 µL即用型CFSE标记溶液中。
   5. 在37 °C下孵育细胞15分钟，然后在300 x g离心后收集细胞 g 3 分钟。
   6. 将标记的细胞重悬于1 mL预热的细胞培养基中，在37 °C条件下孵育30分钟以恢复细胞状态。
   7. 通过300 x g离心收集细胞 g 3分钟后，将细胞沉淀重悬于1 mL预热至37 °C的即用型DNA染色液中，孵育10分钟。
   8. 离心收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于4 mL 1×PBS中。使用血细胞计数板测定细胞密度，并在配备4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片的荧光显微镜下观察荧光标记情况。图1A和1E).
   9. 以 300 x g 离心细胞 g 孵育3分钟，然后根据下一节所述实验所需的细胞密度重悬细胞沉淀，并置于冰上。

2. 为导线充电

注意：细胞可从目标细胞/外周血加样中以毫升规模分离，或以微升规模提供少量细胞。前者可用于模拟外周血中的稀有细胞状态，而后者可能是为优化/测试实验方案目的附着少量细胞的首选方法。

1. 使用大量细胞悬液对导线进行负载
   1. 通过将 0.8 g BSA 溶解于 40 mL 1× PBS（用于细胞培养）中制备 2% BSA 封闭液。先通过涡旋混合使 BSA 溶解，随后在室温下置于水平滚轴混合器上孵育 10–20 分钟以完成溶解。
   2. 用 2 mL 2% BSA 冲洗空的 EDTA 管或肝素钠管，以去除抗凝剂残留，然后弃去溶液。在水平滚轴混合器上以 15 rpm 的速度于室温下用 5 mL 2% BSA 孵育 30 分钟以封闭管壁表面，之后弃去溶液。
   3. 将已标记的细胞（第 1.2 节）稀释至密度为 100,000 个细胞/mL，并取 5 mL 用于对导线进行负载。
   4. 向管中加入 5 mL 已标记的细胞悬液（总计 500,000 个细胞）。添加细胞悬液时应避免产生气泡。
   5. 从储存室中取出导线及其固定用的橡胶帽，并用 1× PBS 冲洗导线（图 2）。
   6. 使用注射器针头（20 G）穿透 EDTA 管的橡胶管帽（步骤 2.1.4），插入导线，确保当管帽重新盖回管上并将管置于倾斜滚轴混合器上时，导线的功能部分完全浸没在细胞悬液中。
      注意：在整个负载过程中，导线的三螺旋功能部分应始终被细胞悬液覆盖。
   7. 将管置于倾斜滚轴混合器上以 5 rpm 转速旋转 30 分钟，使细胞充分附着于导线表面。
   8. 用 5 mL 1× PBS 冲洗导线，并将其在避光条件下储存于含有 1× PBS 的 15 mL 管中，温度保持在 2–6 °C，直至进行显微观察。
      注意：导线的功能部分必须始终浸没在 PBS 中，以避免对细胞造成损伤。
2. 从外周血人工混合物中分离目标细胞（替代方法：2.1. 使用大量细胞悬液对导线进行负载）
   1. 将已标记的细胞（第 1.2 节）进行稀释，获得高细胞密度的细胞悬液（> 1,000,000 个细胞/mL），从而减少加入外周血中的细胞悬液体积。
   2. 将 500 至 500,000 个细胞加入 5 mL 外周血中，并通过翻转混匀管内液体。
   3. 从储存室中取出导线，移除固定导线的橡胶帽，并用 1× PBS 冲洗导线。
   4. 使用注射器针头（20 G）穿透新管帽，将装置的非功能部分插入，确保当管帽重新盖回管上并将管置于倾斜滚轴混合器上时，导线的功能部分完全浸没在加标血液中。
      注意：在整个负载过程中，导线的三螺旋功能部分应始终被细胞悬液覆盖。
   5. 将管置于倾斜滚轴混合器上，在室温下以 5 rpm 转速孵育 30 分钟。
   6. 用 1× PBS 对导线冲洗三次，并将其在避光条件下储存于含有 1× PBS 的 15 mL 管中，直至进行显微观察。
      注意：导线的功能部分必须始终浸没在液体中，以避免对细胞造成损伤。
3. 使用低体积细胞悬液对导线进行负载（替代方法：2.1. 使用大量细胞悬液对导线进行负载）
   1. 将标记后的细胞以 1,000,000 个细胞/mL 的浓度重悬于 1× PBS 中。
   2. 将一支 150 mm 的一次性玻璃巴斯德吸管水平固定在支架上。
   3. 从储存室中取出导线，但保留固定导线的黄色橡胶帽。
   4. 将导线放入巴斯德吸管中，使功能化部分位于巴斯德吸管尖端内，且不接触玻璃壁。
      注意：导线尖端不应伸出巴斯德吸管尖端外。避免用固定导线的橡胶帽堵塞巴斯德吸管尖端的后端。若密封过紧，则无法从另一侧将细胞悬液加载至吸管尖端内。
   5. 将 15 µL 细胞悬液加载至巴斯德吸管尖端，确保完全覆盖导线的功能化部分。
   6. 孵育导线 10 分钟。每分钟手动将组装好的导线/巴斯德吸管尖端旋转四分之一圈。
   7. 从巴斯德吸管尖端取出导线，用 5 mL 1× PBS 冲洗，并将其在避光条件下储存于含有 1× PBS 的 15 mL 管中，温度保持在 2–6 °C，直至进行显微观察。
      注意：功能部分必须始终浸没在 1× PBS 中，以避免对细胞造成损伤。

3. 统计导线上的细胞数量

注意：始终将导线的功能部分浸没在 1× PBS 中，以避免对细胞造成损伤。

1. 使用记号笔在玻璃载玻片上画出一个矩形区域，并加入 500 µL 的 1× PBS。
2. 将导线的非功能部分弯折，并将其放置在玻璃载玻片上，使功能部分浸入 1× PBS 中。
   注意： 矩形区域的大小和 1× PBS 的体积应足以完全覆盖导线的功能部分。使用双面胶带将导线的非功能部分固定在载玻片上。
3. 用显微镜目视检查导线两侧，以统计捕获的细胞数量（图 1B 和 1F）。
   注意： 使用配备 DAPI 和 FITC 滤光片的荧光显微镜判断细胞的存在。可对导线两侧进行检查，若细胞数量较多则进行估算，若附着细胞数量较少则可直接计数。如果无需统计细胞数量，此步骤可省略。
4. 扫描完成后，将导线放回含有 1× PBS 的 15 mL 离心管中，并置于避光处保存。
   注意： 可剪除大部分非功能部分（包括弯折部分），以便于储存。

4. 目标细胞的脱离与回收

注意：细胞分离后须在 4 小时内完成消化。

1. 每毫升 1x PBS 中溶解 4 mg 的释放缓冲液组分（材料与试剂表），并通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤，得到可直接使用的缓冲液。
   注意： 导线的聚合物由一种水凝胶构成，该水凝胶经抗 EpCAM 抗体功能化修饰，可与表达 EpCAM 的靶细胞结合。释放缓冲液含有一种碳-氧蛋白水解酶，能够切割该水凝胶。蛋白水解作用导致聚合物降解，从而使捕获的细胞脱落。
2. 将释放缓冲液在 37 °C 预热 5 分钟。
3. 向 1.5 mL 反应管中加入 1.6 mL 释放缓冲液以充满管体。
   注意： 设计容量为 1.5 mL 的反应管可容纳 1.6 mL 液体，这对于完全浸没导线的功能部分是必要的。
4. 将导线的功能部分浸入释放缓冲液中，在 37 °C（水浴）孵育 20 分钟。使用随导线提供的橡胶帽代替管盖，将导线固定在 1.5 mL 管中，以避免水浴孵育过程中发生污染。
5. 将导线/管组件转移至室温下的摇床，以 500 rpm 振荡 15 分钟。
   注意： 摇床的振荡直径为 1.5 mm。
6. 将导线/管组件放入离心机，以 300 x g 离心 10 分钟。
7. 从管中取出导线，盖紧管盖后再次以 300 x g 离心 10 分钟。
   注意： 导线可在避光条件下于 2–6 °C 的 1x PBS 中保存，用于后续细胞计数，以评估细胞脱落效率或检测导线上残留的细胞。
8. 为减少细胞悬液的体积，保留上清液 100 µL（用于显微操作）或另选保留 300 µL（用于细胞离心及后续激光显微切割），弃去其余部分，并立即进行单细胞取样。

结果

图1： 可视化标记细胞。 （A，E） 充电前的细胞：细胞用CFSE标记，并用DNA嵌入染料进行复染，显示CFSE（绿色）信号强度的差异。 (B,F) 导线上捕获的标记细胞。 (C,G) 细胞脱离程序后的导线。D,H细胞从金属丝上脱落，并通过细胞离...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gilupi 释放缓冲液	Gilupi	GIL083	用于将细胞从金属丝上分离
McCoy's 5A 培养基（1×），添加 L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	16600-082	用于 HT-29 细胞的培养基，根据实验所用的细胞系调整培养基
HEPES缓冲液（1 M）	聚丙烯酸	S11-001	5A 培养基补充剂
优质胎牛血清	聚丙烯酸	A15-151	McCoy's 5a 改良培养基添加剂
青霉素-链霉素（100倍浓缩液）	Biowest	L0018-100	McCoy's 5a 改良培养基添加剂
磷酸盐缓冲液（1x PBS）	赛默飞世尔科技	10010-015
Accutase	Biowest	L0950-100	细胞解离液（细胞培养）
水浴锅	GFL	1型1003	用于预热溶液
培养箱	赛默飞世尔科技		用于细胞培养（细胞孵育）
50 mL 离心管	VWR	525-0403
滚轴混合器	Stuart Scientific	SRT6D	用于将细胞固定在金属丝上，同时防止细胞沉降
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒	赛默飞世尔科技	C34554	用于标记活细胞（胞质标记）
Hoechst 33342	H3570	赛默飞世尔科技	用于染色DNA（核酸复染）
离心机（配备可容纳15 mL和50 mL反应管的转子）	赛默飞世尔科技	Heraeus Megafuge 40R	用于细胞沉淀
观察者 Z1（荧光/激光显微切割显微镜）	卡尔·蔡司显微成像		能够进行激光显微切割的倒置（免疫荧光）显微镜；荧光显微镜必须能够检测Hoechst 33342（DAPI滤光片）和CFSE（FITC滤光片）
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4503-50G	用于包被玻璃/塑料表面
MS1 Minishaker	Sigma-Aldrich	Z404039	用于涡旋混合
Vacutainer EDTA（或 Na-肝素）抗凝管	BD	366450（或 366480）	用作体外捕获靶细胞的反应管
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	可功能化捕获并释放 EpCAM 阳性细胞的导线（亦称捕获）&释放, C&R)
注射器针头（G20）	VWR	613-0554	用于刺穿橡胶帽，以便使C的非功能部分&R 以引领前行
血球计数板	Roth	T729.1	用于细胞计数
巴斯德吸管 150 mm	Volac	D810	用于将细胞低体积接种至 C&R
记号笔	Dako	S2002	用于载玻片上以固定细胞悬液
无菌注射器滤器（0.2 µm)	康宁	431219	用于过滤新配制的Gilupi释放缓冲液
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	1296-003	用于细胞脱离过程中的振荡
1.5 mL 离心管	Eppendorf	30,125,150
Ampli1 WGA 试剂盒	Silicon Biosystems		通过 Silicon Biosystems 进行订购
配备 Mikromanipulator MMJ 和 CellTram vario 的 Axiovert M200 显微镜	蔡司/艾本多夫		手动使用显微操作技术
微毛细管（25 µ直径为 m，CustomTip I 型	Eppendorf	930001201	用于细胞的显微操作
0.2 mL PCR管	Biozym	710920
细胞离心机及设备	Hettich	通用型 32	使用手控细胞离心机
Thermo cycler	Bio-Rad	DNA Engine Dyad	任何带有加热盖的热循环仪均可使用
微型离心机	Roth	CX73.1	使用手边的台式离心机
MembraneSlide 1.0 PET	Zeiss	415101-4401-050	用于激光显微切割的膜包被玻片