功能化基于线的靶细胞分离:一种从加标外周血中分离癌细胞的离体技术

注意:该方案描述了从 PBS 或 HT-29 细胞和外周血的人工混合物中分离 HT-29 细胞（人结肠癌细胞系）。对两种额外的细胞系 （LNCaP 和 VCaP） 进行了相同的实验，理论上可以用所有表达 EpCAM 的细胞进行。

1. 靶细胞的制备

1. 细胞培养和细胞标记
   注意:在该方案中，将细胞在 75 cm² 培养瓶中培养。如果使用其他细胞培养设备（例如，25 cm² 培养皿、6 孔板等），请相应地调整试剂的量。使用的所有液体均在水浴中预热至 37 °C。如果没有特别说明，所有方案步骤均在室温 （RT） 下进行。
   1. 在 37 °C、5% CO₂ 气氛中，在补充有 2 mM L-谷氨酰胺、20 mM Hepes、10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素的 McCoy's 5a 改良培养基中培养 HT-29 细胞。
   2. 当细胞 90% 汇合时，去除培养基并用 10 mL 的 1x PBS 冲洗细胞。
   3. 要收获细胞，向细胞中加入 2 mL 细胞分离溶液（材料和试剂表），并在 37 °C 下孵育细胞约 5 分钟><。 注意:分离溶液含有 1x PBS、0.5 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 和 3 mg/L 酚红中的蛋白水解酶和胶原分解酶。将细胞分离溶液的预热时间降至最低，因为在 37 °C 下 1 小时后它将失活。覆盖整个细胞层以获得最佳的细胞分离。
   4. 使用倒置显微镜检查细胞的脱离。
   5. 将所有分离的细胞转移到预装有 10 mL 细胞培养基的 50 mL 试管中（与步骤 1.1.1 中使用的相同），并通过移液重悬细胞。
   6. 将剩余的细胞悬液放在 RT 的水平滚轮混合器上，然后进行标记步骤。
2. 靶细胞的活细胞标记
   1. 在 1 mL 在 37 °C 预热的 1x PBS 中稀释 1 μL 5 mM CFSE（以二甲基亚砜，DMSO 形式提供），以获得 5 μM 即用型 CFSE 标记溶液><。 注意:为获得最佳染色结果，请使用新鲜制备的溶液。
   2. 在1x PBS中制备即用型DNA染色溶液（材料和试剂表），并将其储存在2-6°C避光><。 注意:为获得最佳染色结果，请使用新鲜制备的溶液。
   3. 从卧式滚轮混合器中取出细胞（步骤 1.1.6.），并以 300 x g 的离心沉淀细胞 10 分钟。去除上清液，将细胞重悬于 10 mL 的 1x PBS 中。
   4. 用 1x PBS 再次冲洗细胞，并将细胞沉淀重悬于 500 μL 即用型 CFSE 标记溶液中。
   5. 将细胞在 37 °C 下孵育 15 分钟，并在以 300 x g 离心 3 分钟后收集细胞。
   将
   6. 标记的细胞重悬于 1 mL 预热的细胞培养基中，并让细胞在 37 °C 下再生 30 分钟。
   7. 通过以 300 x g 离心 3 分钟收获细胞，并将细胞沉淀重悬于 1 mL 即用型 DNA 染色溶液中，在 37 °C 下 10 分钟。
   8. 沉淀细胞，去除上清液，并将细胞重悬于 4 mL 的 1x PBS 中。使用血细胞计数器评估细胞密度，并使用配备有 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 和异硫氰酸荧光素 （FITC） 滤光片的荧光显微镜检查荧光标记（图 1A 和 1E）。
   9. 将细胞以 300 x g 离心 3 分钟，然后根据下一节中给出的相应实验所需的细胞密度重悬细胞沉淀，并置于冰上。

2. 给电线充电

注:可以从毫升级的靶细胞/外周血加标中分离细胞，也可以通过提供少量微升级的细胞来分离细胞。前一种方法允许模拟外周血中的稀有细胞条件，而后者可能是为了方案优化/测试而附着一些细胞的首选方法。

1. 使用大量细胞悬液为导线充电
   1. 通过将 0.8 g BSA 溶解在 40 mL 的 1x PBS 中来制备 2% BSA 封闭溶液（细胞培养用）。通过初始涡旋溶解 BSA，随后在 RT 上在卧式滚筒混合器上孵育 10-20 分钟。
   2. 用 2 mL 2% BSA 冲洗空的 EDTA 管/肝素钠管，以去除抗凝剂残留物并丢弃溶液。通过在卧式滚轮混合器上用 5 mL 2% BSA 在 RT 下以 15 rpm 的速度孵育 30 分钟来堵塞管表面，然后丢弃溶液。
   3. 将标记的细胞（第 1.2 节）稀释至 100,000 个细胞/mL 的密度，并使用 5 mL 为导线充电。
   4. 向试管中加入 5 mL 标记的细胞悬液（总共 500,000 个细胞）。添加细胞悬液时避免气泡。
   5. 从储藏室中取出电线以及固定电线的橡胶帽，然后用 1x PBS 冲洗（图 2）。
   在
   6. 注射器针头 （20 G） 的帮助下穿透 EDTA 管的橡胶管帽（步骤 2.1.4.），并插入金属丝，以便在盖子回到管上并将管子放在倾斜的辊式混合器上时，功能部件完全浸入细胞悬液中><。 注意:在整个充电过程中，导线的三螺旋功能部分应用电池悬浮液覆盖。
   7. 在倾斜的滚轮混合器上以 5 rpm 的速度旋转试管 30 分钟，以使细胞附着在金属丝上。
   8. 用 5 mL 1x PBS 冲洗电线，并将其在 2-6 °C 的 15 mL 管中避光储存在含有 1x PBS 的 15 mL 试管中><，直至目视检查。 注意:导线的功能部分必须始终浸没在 PBS 中，以避免伤害细胞。
2. 从外周血的人工混合物中分离靶细胞（替代充电方法:2.1.使用大量细胞悬液为电线充电）
   1. 稀释标记的细胞（第 1.2 节）以获得高细胞密度 （> 1,000,000 个细胞/mL） 的细胞悬液，从而保持添加到外周血中的细胞悬液体积较低。
   2. 将 500 至 500,000 个细胞添加到 5 mL 外周血中，并通过倒置试管混合它们。
   3. 从储藏室中取出电线，取下固定电线的橡胶帽，然后用 1x PBS 冲洗。
   4. 使用注射器针头 （20 G） 将设备的非功能部分插入新的管帽，以便在将管盖放回管上并将管放在倾斜的滚轮混合器上时，功能部分完全浸入加标血液><中。 注意:在整个充电过程中，导线的三螺旋功能部分应用电池悬浮液覆盖。
   5. 在 RT 下，将试管在倾斜的滚轮混合器上以 5 rpm 孵育 30 分钟。
   6. 在 1x PBS 中冲洗电线 3 次，并将其在含有 1x PBS 的 15 mL 试管中避光储存，直至目视检查><。 注意:导线的功能部分必须始终浸没在水中，以避免伤害细胞。
3. 从低容量细胞悬液中充电（替代充电方法: 2.1.使用大量细胞悬液为电线充电）
   1. 在 1x PBS 中以 1,000,000 个细胞/mL 的浓度重悬标记的细胞。
   2. 将 150 mm 一次性玻璃巴斯德移液器水平固定在架子上。
   3. 从储物箱中取出电线，但保留固定电线的黄色橡胶帽。
   4. 将金属丝放入移液器中，使功能化部分位于巴斯德移液器的尖端，不接触玻璃。
      注意:导线的尖端不应伸出巴斯德移液器尖端。避免用固定导线的橡胶帽堵塞巴斯德移液器吸头的后端。如果连接紧密，则无法将细胞悬液从另一侧加载到移液器吸头中。
   5. 将 15 μL 细胞悬液加载到巴斯德移液器的尖端中，覆盖金属丝的功能化部分。
   6. 孵育导线 10 分钟。每分钟手动将组装好的导线/巴斯德移液器吸头旋转四分之一圈。
   7. 从巴斯德移液器吸头上取下金属丝，用 5 mL 的 1x PBS 冲洗，并在 2-6 °C 的黑暗中储存在含有 1x PBS 的 15 mL 试管中，直至目视检查><。 注意:功能部分必须始终浸没在 1x PBS 中，以避免伤害细胞。

3. 对网络上的单元格进行计数

注意:始终将导线的功能部分浸没在 1x PBS 中，以避免伤害细胞。

1. 使用油笔在载玻片上画一个矩形区域，并加入 500 μL 的 1x PBS。
2. 弯曲导线的非功能部分并将其放在载玻片上，使功能部分浸入 1x PBS 中。
   注意:适合矩形的面积和 1x PBS 的体积，以完全覆盖导线的功能部分。使用双面胶带将导线的非功能部分固定在载玻片上。
3. 目视检查导线的两侧以列举捕获的细胞（图 1B 和 1F）
   注意:使用配备有 DAPI 和 FITC 滤光片的荧光显微镜确定细胞的存在。可以检查导线的两侧，并评估细胞数（细胞数高）或计数（仅当细胞数较少时连接到导线上时才可行）。如果不需要单元格枚举，则可以跳过此步骤。
4. 扫描后，将电线放回含有 1x PBS 的 15 mL 试管中，将电线避光存放。
   注意:电线的大部分非功能部分可以切割（包括弯曲）和移除，从而简化存放。

4. 靶细胞的分离和恢复

注意:细胞分离应在分离后 4 小时内完成。

1. 每 mL 1x PBS 溶解 4 mg 释放缓冲液组分（材料和试剂表），并通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤溶液以获得即用型缓冲液><。 注意:导线的聚合物由水凝胶组成，该水凝胶与抗 EpCAM 抗体功能化，允许与 EpCAM 呈递的靶细胞结合。释放缓冲液含有能够裂解水凝胶的碳氧蛋白水解酶。蛋白水解裂解导致聚合物降解，从而分离捕获的细胞。
2. 将释放缓冲液在 37 °C 下预热 5 分钟。
3. 加入 1.6 mL 释放缓冲液，填充 1.5 mL 反应管。
   注意:设计用于 1.5 mL 反应体积的试管允许应用 1.6 mL，这是浸没导线功能部分所必需的。
4. 将金属丝的功能部分在 37 °C（水浴）的释放缓冲液中孵育 20 分钟。使用金属丝随附的橡胶帽代替管帽将金属丝固定在 1.5 mL 管中，以避免在水浴中孵育时受到污染。
5. 将线材/管材组件转移到 RT 和 500 rpm 的摇床上 15 分钟
   注意:振动台的轨道为 1.5 mm。
6. 将线/管组件放入离心机中，并以 300 x g 的速度旋转 10 分钟。
7. 从试管中取出电线，盖上盖子，然后再次以 300 x g 离心试管 10 分钟
   注意:线材可以在2-6°C下在黑暗中储存在1x PBS中用于细胞计数，以评估分离效率/检查细胞线上残留的细胞。
8. 为了减少细胞悬液的体积，除 100 μL（显微作）或 300 μL（细胞离心和随后的激光显微切割）上清液外，除去所有上清液，并立即进行单细胞采样。

图 1:可视化标记的细胞。（A，E） 充电前的细胞:用 CFSE 标记细胞，并用 DNA 嵌入染料复染，显示一系列 CFSE（绿色）信号强度。（B，F） 在导线上捕获的标记细胞。（C，G） 细胞分离程序后的导线。（D，H）细胞从金属丝上分离并通过细胞离心回收到载玻片上。CFSE:FITC 通道（绿色）。DNA 染色:DAPI 通道（蓝色）。

图 2:图 2:电线和储物箱。（A） 电线的隔室。（B） 功能化部分的细节。