使用显微操作进行单细胞取样：一种从癌细胞悬液中分离单个细胞的技术

摘要

来源：Chen S. 等。靶细胞预富集与全基因组扩增用于单细胞下游表征。J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了从目标细胞群体中分离单个细胞以进行下游分析的技术。该方法使用安装在显微镜上的显微操作仪，实现对单个目标细胞的高精度分离。

方案

1. 单细胞取样

1. 显微操作
   ​注意：为了便于后续应用，如全基因组扩增（WGA），分离的单细胞将被加入到 2 µL 细胞裂解主混合液中。根据待处理细胞的数量配制主混合液。计算移液过程中可能的损耗量，并将细胞裂解主混合液置于冰上。
   1. 配制细胞裂解主混合液（全基因组扩增试剂盒组分， 材料与试剂表）。简要操作如下：将 2.0 µL 反应缓冲液、1.3 µL 辛基苯基聚乙二醇醚（10% 溶液）、1.3 µL 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（10% 溶液）、2.6 µL 蛋白酶K溶液以及 12.8 µL 无RNase/DNase水混合，得到可处理10个样本的主混合液（总体积为20 µL）。
      注意： 若样本数量更多，相应增加各组分体积。     
   2. 使用记号笔在载玻片上标记一个区域以固定细胞悬液。若细胞密度过高，则调整标记区域和体积（例如，在载玻片上标记更大的区域，加入1×PBS和一份细胞悬液）。
   3. 将全部目标细胞悬液用移液器加至载玻片上。
   4. 将载玻片转移至配备显微操作仪的显微镜下，静置5分钟使细胞沉降。
   5. 准备装有2.0 µL细胞裂解主混合液（步骤1.1.1中配制）的0.2 mL PCR管，并置于冰上保存。
   6. 使用显微操作仪在1 µL 1×PBS中捕获单个细胞，并将其转移至含有细胞裂解主混合液的PCR管中。
      注意： 将显微操作获得的细胞转移至裂解缓冲液时，将毛细管直接插入2 µL裂解液中，持续推出液体直至可见气泡。
   7. 使用台式小型离心机短暂离心样本，2000 x g 离心3秒，使管内所有液体聚集至管底。将样本置于冰上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（1x PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010-015
Vacutainer EDTA（或 Na-肝素）管	BD	366450（或 366480）	用作体外捕获靶细胞的反应管
巴斯德吸管，150 mm	Volac	D810	用于向C&R装置低体积加样细胞
玻璃标记笔	Dako	S2002	用于在玻片上标记以固定细胞悬液位置
配备Mikromanipulator MMJ和CellTram vario的Axiovert M200倒置显微镜	Zeiss/Eppendorf		使用现有的显微操作仪
微毛细管（直径25 µm），CustomTip I型	Eppendorf	930001201	用于细胞的显微操作
0.2 mL PCR管	Biozym	710920