来源：Chen S. 等。靶细胞预富集与全基因组扩增用于单细胞下游表征。J. Vis. Exp. (2018)
本视频介绍了利用激光捕获显微切割技术从异质细胞群体中获取单个细胞的方法。分离得到的单个细胞可用于后续基因组学研究或癌症研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
使用激光显微切割进行单细胞取样：一种从异质细胞群体中分离目标细胞的技术
3K 次观看
⸱
2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
1. 单细胞取样
- 激光显微切割
注意：单个细胞将被加入 4.5 µL 细胞裂解主混合液（WGA 试剂盒组分，参见材料与试剂表）中进行全基因组扩增（WGA）。- 根据 Czyż 等 的方法配制细胞裂解主混合液：将 5.0 µL 反应缓冲液、1.3 µL 辛基苯基聚乙二醇醚（10% 溶液）、1.3 µL 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（10% 溶液）、2.6 µL 蛋白酶 K 溶液以及 34.8 µL 无 RNase/DNase 水混合，配制成适用于 10 个样本的主混合液（总体积 45 µL）。将主混合液置于冰上。
注意：若需处理更多样本，按比例增加各组分体积。 - 对适用于激光显微切割的膜包被载玻片进行紫外线（UV）处理。将载玻片放入 DNA 交联仪中，用最强 UV 照射约 10 分钟。
- 将膜包被载玻片安装至细胞离心机中，以 300 × g 离心 5 分钟，使全部细胞悬液沉降。
注意：若使用液体系统（即细胞在溶液中离心至载玻片上），在细胞离心后移除上清液，并以 1140 × g 干离心 1 分钟。 - 可立即进行激光显微切割，或让细胞沉淀在空气中干燥过夜，随后将样本于 -20 °C 冷冻保存以长期储存。
- 将 4.5 µL 细胞裂解主混合液加入 0.2 mL PCR 管盖内，通过激光显微切割收集单个细胞。
- 从激光显微切割显微镜中取出 PCR 管并盖紧管盖。短暂离心以收集管底液体，并将样本置于冰上。
- 立即进行单细胞全基因组扩增（WGA），或在进一步处理前将分离的样本于 -80 °C 保存最多 1 个月。
- 根据 Czyż 等 的方法配制细胞裂解主混合液：将 5.0 µL 反应缓冲液、1.3 µL 辛基苯基聚乙二醇醚（10% 溶液）、1.3 µL 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（10% 溶液）、2.6 µL 蛋白酶 K 溶液以及 34.8 µL 无 RNase/DNase 水混合，配制成适用于 10 个样本的主混合液（总体积 45 µL）。将主混合液置于冰上。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含L-谷氨酰胺的McCoy's 5A培养基（1x） | 赛默飞世尔科技 | 16600-082 | 用于HT-29细胞的培养基，根据实验所用细胞系调整培养基 |
| HEPES缓冲液（1 M） | PAA | S11-001 | 5A 培养基补充剂 |
| 优级胎牛血清 | PAA | A15-151 | 改良型McCoy's 5a培养基添加剂 |
| 青霉素-链霉素（100倍浓缩） | Biowest | L0018-100 | McCoy's 5a 改良培养基添加剂 |
| 磷酸盐缓冲液（1x PBS） | 赛默飞世尔科技 | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | 细胞解离液（细胞培养） |
| 水浴锅 | GFL | 1型1003 | 用于预热溶液 |
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 用于细胞孵育（细胞培养） | |
| 50 mL 离心管 | VWR | 525-0403 | |
| 滚轴混合器 | Stuart Scientific | SRT6D | 用于将细胞固定在金属丝上，同时防止细胞沉降 |
| CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | C34554 | 用于标记活细胞（胞质标记） |
| Hoechst 33342 | H3570 | 赛默飞世尔科技 | 用于染色DNA（核酸复染） |
| 离心机（配备可容纳15 mL和50 mL反应管的转子） | 赛默飞世尔科技 | Heraeus Megafuge 40R | 用于细胞沉淀 |
| 观察者 Z1（荧光/激光显微切割显微镜） | 卡尔·蔡司显微成像 | 能够进行激光显微切割的倒置（免疫荧光）显微镜；荧光显微镜必须能够检测Hoechst 33342（DAPI滤光片）和CFSE（FITC滤光片） | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4503-50G | 用于包被玻璃/塑料表面 |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | 用于涡旋震荡 |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | 能够分离和释放EpCAM阳性细胞的功能化导线（亦称为捕获）&和释放，C&R) |
| 注射器针头（G20） | VWR | 613-0554 | 用于刺穿橡胶帽，以便使C的非功能部分&R 引领前行 |
| 血细胞计数板 | Roth | T729.1 | 用于细胞计数 |
| 巴斯德吸管 150 mm | Volac | D810 | 用于将细胞低体积接种至 C&R |
| 记号笔 | Dako | S2002 | 用于载玻片上以固定细胞悬液 |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | 用于细胞解离过程中的振荡 |
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA 试剂盒 | Silicon Biosystems | 通过 Silicon Biosystems 进行订购 | |
| 0.2 mL PCR管 | Biozym | 710920 | |
| 细胞离心机及设备 | Hettich | 通用 32 | 使用手控细胞离心机 |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | 任何带有加热盖的热循环仪均可使用 |
| 微型离心机 | Roth | CX73.1 | 使用手边的台式离心机 |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | 使用手持式DNA交联仪 |
