来源：Anker, J. F. 等. 雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌的生物发光与荧光同基因小鼠原位模型。J. Vis. Exp. (2018)
在本视频中，我们演示了将前列腺癌细胞注射到小鼠前列腺内的操作步骤。原位小鼠模型可用于在非侵入性且具有临床相关性的环境中研究疾病的发生机制以及对治疗方案的反应。
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方法文章
前列腺内注射癌细胞：建立原位前列腺癌小鼠模型的癌细胞递送技术
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。
1. 术前小鼠准备
注意：手术前至少将家鼠饲养于大学动物饲养设施中一周，以确保其充分适应并尽量减少动物应激。步骤 1.1–1.6 由外科医生的助手完成。所有后续手术步骤均由外科医生使用无菌手套和无菌器械，遵循无菌技术进行。
- 使用异氟烷麻醉小鼠（通过麻醉舱诱导时浓度为2-5%，通过鼻罩维持时浓度为1-3%）。通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉完全。
- 称重小鼠，并皮下注射至少 0.05 mg/kg 的镇痛剂 buprenorphine。
注意： 小鼠体重≥20 g是成功进行前列腺内注射的理想条件。 - 为双眼涂抹眼膏以润滑，防止角膜干燥。
- 剃除腹部所有毛发。
- 使用无菌不粘敷料蘸取外科消毒液，以腹部为中心进行三轮环形擦拭消毒，随后用无菌酒精湿巾擦拭，待腹部自然晾干。
注意： 在手术过程的其余步骤中，必须仅使用无菌手套和手术器械接触已消毒的小鼠腹部。 - 将小鼠仰卧置于加热垫上干净的表面，正对洁净手术显微镜的物镜下方。
- 用无菌手术巾覆盖小鼠，腹部位置剪一个小孔暴露手术区域。
2. 前列腺内注射
注意：所有手术步骤均须在无菌条件下进行。调节显微镜、小鼠体位或任何其他非无菌物品时，必须由额外人员协助完成。
- 在阴茎和包皮腺上方腹部正中线处，对外侧皮肤进行约1 cm的切口（图1D）。
- 用剪刀在组织层之间分离外侧腹壁皮肤与内侧腹肌之间的结缔组织。
- 用镊子提起腹肌，避免刺破肠道或膀胱，沿内侧腹肌做类似切口（图1D）。
- 寻找一侧成对的精囊（图1A，白色）或前叶前列腺（图1A，黑色），它们通常位于膀胱（图1A，黄色）的后方、外侧并略偏上方，但小鼠个体之间可能存在差异。前叶前列腺呈半透明状，附着于白色精囊的小弯侧。
- 使用Graefe组织镊轻轻提起精囊尖端，使组织产生张力，但避免刺破精囊（图1E）。
- 由手术助手轻柔吹打重悬Myc-CaP Matrigel溶液（细胞可能已沉淀），缓慢吸取30 µL（1×106细胞）至注射针内，避免产生气泡。
- 将针头斜面小心平行于前叶前列腺长轴方向插入，缓慢注入30 µL溶液后，再缓慢退出针头以防止泄漏（图1F）。通过观察前叶前列腺是否肿胀来确认注射到位（图1G）。
- 将精囊及注射后的前列腺叶小心保持在小鼠体外约30秒，使Matrigel在腺叶内部分凝固。在此期间，使用无菌聚酯棉签收集腹腔内可能渗出的细胞悬液，避免压迫注射部位，以防异位肿瘤形成。
- 将精囊及注射后的前列腺叶小心放回腹腔，避免对其施加压力，并复位所有外露的组织。
- 使用5-0 Vicryl可吸收反向切割针缝线连续缝合关闭腹内肌层。
- 使用4-0尼龙单丝不可吸收反向切割针缝线间断缝合关闭外侧腹壁皮肤。注意：也可使用已灭菌的9 mm钉合器关闭外侧腹壁皮肤，但与缝线相比，钉合器会干扰后续的生物发光及荧光肿瘤成像信号。
- 用无菌乙醇擦拭布（由手术助手开启）清洁所有器械，并将其置于玻璃珠灭菌器中灭菌30秒。待器械干燥后方可用于下一只小鼠。
- 用无菌生理盐水（由手术助手开启）冲洗注射器和针头，防止残留Matrigel造成堵塞。
注意：所有手术操作均应配备一名手术助手，负责完成所有非无菌的术前小鼠准备和术后护理工作，并在注射前混合Myc-CaP Matrigel溶液。为节省时间（每只小鼠的前列腺内注射操作需20–30分钟），当术者正在为当前小鼠缝合时，助手可开始准备下一只小鼠。
3. 小鼠术后护理
- 术后立即、24 小时和 48 小时，皮下注射 1 mg/kg 镇痛药美洛昔康。
- 将小鼠置于垫料仅铺一半的笼子中，并将笼子一半放置在加热垫上进行恢复。术后至少监测小鼠 30 分钟，直至其恢复正常活动能力和行为，随后将其转移至底部铺有食物的清洁笼子中。
- 术后每日继续监测小鼠伤口愈合情况、体重、理毛行为及活动能力。一旦发现打斗迹象，立即将小鼠分笼饲养。
- 术后 14 天内拆除所有残留缝线。
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结果
图1： 前列腺前叶、引流淋巴结及前列腺内细胞注射的代表性技术。图示(A) 右侧前列腺前叶（黑色，*）、附着的右侧精囊（白色）、右侧睾丸及脂肪垫（绿色）和膀胱（黄色）；(B) 双侧前列腺引流的腹主动脉旁淋巴结（橙色）；(C) 显微解剖剪、格拉夫镊子、格拉夫组织镊、带剪线器的持针器，以及装有28号针头的50 µL注射器（从左到右）；(D) 正中切口；(E) 精囊和前列腺前叶的外翻；(F) 前列腺内注射；以及(G) 前列腺前叶...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Myc-CaP 细胞系 | ATCC | CRL-3255 | 使用前需验证无支原体污染 |
| 显微解剖剪 | Roboz | RS-5910 | |
| Graege 组织镊 | Roboz | RS-5135 | |
| Graefe 组织镊 | Roboz | RS-5150 | |
| Olsen-Hegar 带剪刀功能的持针钳<br/> | FST | 12002-12 | |
| 50 µL 注射器 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | 使用环氧乙烷气体灭菌 |
| 28 号针头 小接头 RN H | Hamilton | 7803-02 | 尖端类型 4，角度 45°，长度 0.75 英寸。使用环氧乙烷气体灭菌 |
| RPMI | Gibco | 18875-093 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Matrigel 基底膜<br/> 基质，无酚红，无 LDEV | Corning | 356237 | 使用前在冰上解冻，或于 4°C 过夜<br/> |
| 异氟烷 | Henry Schein | 11695-0500-2 | 由美国西北大学比较医学中心（CCM）获取 |
| 盐酸布托啡诺 0.3<br/> mg/mL | 12496-0757-5 | 管制药品，由美国西北大学 CCM<br/> 获取 | |
| 26 5/8 号注射器 | BD | 309597 | 用于美洛昔康和布托啡诺注射 |
| 眼用润滑软膏 | Akron | 17478-162-35 | |
| 聚维酮碘外科消毒液（7.5%） | Purdue Products | 67618-151-16 | |
| 无菌不粘敷料垫 | Moore Medical | 10775 | |
| 无菌酒精擦拭巾 | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| 手术显微镜 Stemi DV4 | Zeiss | ||
| 无菌聚酯棉签 | Puritan | 25-806 1PD | |
| 5-0 Vicryl 可吸收反向切割缝合针线 | eSutures | J493G | |
| 4-0 尼龙单丝不可吸收反向切割缝合针线 | eSutures | 699H | |
| 玻璃珠灭菌器 | 细科学工具公司（Fine Science Tools） | 18000-45 | |
| 无菌生理盐水 0.9% 氯化钠 | Hospira | 0409-4888-02 |
