癌细胞的前列腺内注射:一种递送癌细胞以建立原位前列腺癌小鼠模型的技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 小鼠术前准备

注意:手术前至少一周将老鼠放在大学动物设施中，以便充分适应并最大限度地减少动物压力。步骤 1.1-1.6 由外科医生的助手执行。所有后续手术步骤均由外科医生使用无菌手套和采用无菌技术的手术工具进行。

1. 用异氟醚麻醉小鼠（2-5% 通过腔室诱导，1-3% 通过鼻锥维持）。通过脚趾捏反射的丧失来验证完全诱导。
2. 称量小鼠并给予至少 0.05 mg/kg 的镇痛药丁丙诺啡 sc
   注意: 小鼠体重 ≥20 g 是成功进行前列腺内注射的理想选择。
3. 为双眼涂抹眼膏润滑，以防止角膜干燥。
4. 剃掉腹部的所有毛皮。
5. 使用无菌不粘附垫进行三轮循环手术擦洗，然后使用无菌酒精湿巾对腹部进行消毒。让腹部干燥。
   注意:对于其余的外科手术，只能使用无菌手套和手术器械接触消毒的小鼠腹部。
6. 将鼠标仰卧在干净的手术显微镜物镜正下方的加热垫上的干净表面上。
7. 用无菌窗帘盖住鼠标，在腹部切一个小孔。

2. 前列腺内注射

注意:在无菌条件下执行所有手术步骤。调整显微镜、鼠标位置或任何其他非无菌物体必须在额外帮助下完成。

1. 沿着阴茎和包皮腺上方的腹部中线对外皮进行约 1 厘米的切口（图 1D）。
2. 通过打开各层之间的剪刀，将外腹部皮肤和内腹部肌肉组织之间的结缔组织分开。
3. 在内腹部肌肉上做一个类似的切口，用镊子抬高肌肉，以避免刺穿肠道或膀胱（图 1D）。
4. 找到其中一个双侧精囊（图 1A，白色）/前前列腺叶（图 1A，黑色），它们通常位于膀胱的后部、侧面和略高于膀胱（图 1A，黄色），但这可能因小鼠而异。前前列腺叶是半透明的，并附着在白色精囊的较小曲率上。
5. 使用 Graefe 组织镊子轻轻抬起精囊的尖端，以在组织上产生张力，而不会刺穿精囊（图 1E）。
6. 通过外延移液（由外科医生助理执行）混合 Myc-CaP 基质胶溶液，因为细胞可能已经沉淀，然后缓慢吸出 30 μL（1x10^{6 个}细胞）到针头中以避免气泡。
7. 小心地插入平行于前前列腺叶长轴的针头斜面。缓慢将 30 μL 注入肺叶，然后缓慢缩回针头以防止泄漏（图 1F）。通过前列腺前叶充血来验证注射是否充分（图 1G）。
8. 小心地将精囊和前列腺叶保持在小鼠外约 30 秒，以使基质胶在小鼠叶内部分凝固。在此期间，使用无菌聚酯尖端涂抹器收集腹部渗漏的任何细胞溶液，以防止非原位肿瘤发展，而不会压迫注射的前列腺叶。
9. 小心地将精囊和注射的前列腺叶送回腹部，不要对肺叶施加压力。更换任何外化组织。
10. 用 5-0 vicryl 可吸收反向切割针缝合线进行连续缝合以闭合内腹部肌肉。
11. 使用 4-0 尼龙单丝不可吸收的反向切割针缝合线进行间断缝合以闭合外腹部皮肤。注意:消毒的 9 毫米钉也可用于闭合腹部外层皮肤。然而，与缝合线相比，它们会干扰任何后续的生物发光和荧光肿瘤成像信号。
12. 用无菌乙醇湿巾（由外科医生的助手打开）清洁所有工具，并将它们放入玻璃珠消毒器中 30 秒。在下一只鼠标上使用之前，让工具干燥。
13. 用无菌生理盐水（由外科医生的助手打开）冲洗注射器和针头，以防止残留的基质胶堵塞。
    注意:所有手术都应有一名外科医生助理在场，进行所有非无菌的术前小鼠准备和术后小鼠护理，以及在注射前混合 Myc-CaP 基质胶溶液。为了最大限度地节省时间，由于每个前列腺内小鼠手术需要 20-30 分钟，外科医生助理可以在外科医生缝合当前小鼠时开始准备下一只小鼠。

3. 术后小鼠护理

1. 手术后立即、24 小时和 48 小时施用 1 mg/kg 镇痛药美洛昔康皮下注射。
2. 让小鼠在没有床上用品的笼子中恢复，将加热垫放在一半。手术后监测小鼠至少 30 分钟，直到它们恢复正常的活动和活动，然后将它们放在干净的笼子中，食物放在笼子的地板上。
3. 每天进一步监测小鼠的伤口愈合、体重、梳理和手术后的行走情况。如果有任何打架的证据，将老鼠分装到单独的笼子里。
4. 手术后 14 天内拆除所有剩余的缝合线。

图 1:前前列腺叶、引流淋巴结和前列腺内细胞注射的代表性技术。（A） 右前前列腺叶（黑色，*）、附着的右精囊（白色）、右睾丸和脂肪垫（绿色）和膀胱（黄色）的图像，（B） 双侧前列腺引流主动脉旁淋巴结（橙色），（C） 显微解剖剪刀、Graefe 镊子、Graefe 组织镊子、带缝合刀的持针器和带 28 号针头的 50 μL 注射器（从左到右）， （D） 中线切口，（E） 精囊和前前列腺叶外化，（F） 前列腺内注射，以及 （G） 前前列腺叶充血。