生成耐化疗的前列腺癌细胞：一种体外获得耐药性癌细胞的实验方法

摘要

来源：Mohr, L. 等. 抗有丝分裂药物多西他赛耐药前列腺癌细胞模型的建立. J. Vis. Exp. (2017)

本视频介绍了一种建立前列腺癌紫杉烷耐药细胞模型的实验方案。这些模型有助于研究前列腺癌患者进展为多西他赛耐药所涉及的分子通路。

方案

1. 多西他赛耐药性前列腺癌细胞的制备

注意：使用用于确定 IC50 药物浓度的多西他赛溶液储备液进行细胞处理（预先准备足量储备液以供实验使用）。在整个实验过程中，应将亲本细胞平行培养于一个小培养瓶中，并用相应体积的溶剂（DMSO）处理，模拟多西他赛处理组培养瓶中所用的溶剂用量。

1. 将DU145或22Rv1细胞接种于含有20 mL培养基的150 cm²培养瓶中（DU145每瓶接种3.5 × 10⁶个细胞，22Rv1每瓶接种6.5 × 10⁶个细胞）。建议使用10至20个培养瓶，以确保在实验结束时获得足够数量的细胞。
2. 24小时后，当细胞融合度达到约70–80%时（图1B，多西他赛处理前），加入IC50浓度的多西他赛（本实验方案中所述细胞的IC50为5 nM）。
3. 72小时后，吸除含药培养基，更换为新鲜的不含多西他赛的培养基（图1B，多西他赛处理后72小时）。每3–4天更换一次培养基。大约1–2周内，可在显微镜下观察到耐药克隆的出现（图1B，多西他赛处理后7天和14天）。
4. 吸除培养基，用15 mL PBS小心洗涤细胞，随后加入4 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育3–5分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。
5. 用8 mL新鲜培养基重悬消化后的细胞，并合并所有处理组培养瓶中的细胞。通过离心（300 × g，3分钟，室温）收集细胞。
6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20 mL新鲜培养基中，接种至150 cm²培养瓶中（DU145每瓶3.5 × 10⁶个细胞，22Rv1每瓶6.5 × 10⁶个细胞）。
7. 24小时后，当细胞融合度达到约70–80%时，再次加入5 nM多西他赛（初始IC50浓度）。
8. 在第3天重复步骤1.3至1.6。
9. 24小时后，当细胞融合度达到约70–80%时，用2倍IC50浓度的多西他赛（本实验方案中所述细胞为10 nM）处理细胞。
10. 重复步骤1.3至1.8，逐步提高多西他赛浓度（25 nM、50 nM、100 nM和250 nM），以获得能在最终最高浓度下稳定生长的细胞群体。对于更高浓度，可将剂量递增方案持续实施长达6个月，直至达到1,000 nM浓度（图2A）。

结果

图1：多西他赛耐药性前列腺癌细胞模型系统的建立。（A）示意图展示在亲本前列腺癌细胞系DU145和22Rv1中测定多西他赛IC50值的过程（方案步骤1）。图中包含预期的细胞存活率百分比以及所需的多西他赛剂量递增浓度。代表性DU145和22Rv1细胞存活率曲线显示，在多西他赛处理72小时后，IC50值为5 nM。实验重复三次，数据表示为均值±标准差。（B）在建立多西他赛耐药性的过程中（方案步骤2），于指定时间点拍摄的DU145和22Rv1细胞的代表性明场显微镜图像。红色箭头指示完成方案后出现的一个多西他赛耐药克隆。比例尺 = 50 nm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DU145 细胞	ATCC	HTB-81
22Rv1 细胞	ATCC	CRL-2505
多西他赛	Selleck Chemicals	S1148	溶于 DMSO（10 mM）
150 cm² 细胞培养瓶	Falcon	355001
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875093	添加 10% 胎牛血清和<br/> 1% 青霉素/链霉素
Foundation B 胎牛血清	Gemini	900208
1× 磷酸盐缓冲液<br/>（PBS）	Corning	21-040-CM
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-062
青霉素-链霉素	Gibco	15140122