功能化疗耐药性表征：利用克隆形成实验评估癌细胞药物耐药性的方法

摘要

来源：Mohr, L. 等. 抗有丝分裂药物多西他赛耐药前列腺癌细胞模型的建立. J. Vis. Exp. (2017)

本视频介绍了一种利用集落形成实验评估前列腺癌细胞化疗药物耐药性的方法。该实验可作为功能性工具，用于鉴定癌细胞中新的分子和细胞水平的化疗耐药机制。

方案

1. 通过集落形成实验对获得性多西他赛耐药性进行功能表征

注意：在本方案中，使用集落形成实验评估了化疗耐药性。研究人员可根据偏好采用其他评估细胞活力的方法（例如 MTS 实验）。

1. 在6孔板中每孔接种2,000个细胞（DU145或22Rv1，包括亲本株和多西他赛耐药株），每孔加入2 mL培养基。
2. 24小时后，分别向DU145和22Rv1细胞系中加入浓度递增的多西他赛（亲代细胞：0.25、0.5、1、2.5和5 nM；耐药细胞：50、125、250、500和1,000 nM）。在其中一个孔中仅加入与最高多西他赛剂量等体积的DMSO作为对照。
3. 72小时后，吸除含药物的培养基，加入新鲜的不含多西他赛的培养基。
4. 将培养皿孵育1-2周，直至在显微镜下可见菌落。
5. 为染色菌落，用2-3 mL PBS轻轻洗涤，然后在组织培养超净台或通风橱内加入2-3 mL结晶紫溶液（0.1% w/v，溶于10%甲醛），孵育20分钟。
6. 去除染色液，用 2–3 mL H₂O，去除 H₂O 和空气干燥平板。
7. 通过肉眼观察孔板，在记号笔辅助下手动计数菌落（避免重复计数），分析结果，并以图表形式表示细胞存活率的百分比。拍摄培养板的数字图像用于图示展示。图1A).

结果

图1：多西他赛耐药细胞模型的功能与表型表征。（A）亲代细胞和多西他赛耐药细胞在指定浓度多西他赛处理72小时后的代表性集落形成实验结果。附带图表显示各处理浓度下的集落百分比。实验重复三次，数据表示为均值 ± 标准差（SD）。比例尺 = 5 mm。（B）通过qRT-PCR检测的ABCB1、GATA2、CK19和CDH1在耐药细胞/亲代细胞中的相对mRNA表达倍数增加量。所有qPCR原始数据均以Actin为内参进行标准化（详见实验方案）。实验重复三次，数据表示为均值 ± 标准差（SD）。*p <0.05。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DU145 细胞 	ATCC	 HTB-81
22Rv1 细胞  	ATCC	CRL-2505
多西他赛 	Selleck Chemicals	 S1148	 溶于 DMSO（10 mM）
150 cm² 组织培养瓶  	 Falcon	355001
6 孔组织培养板 	 Falcon	353046
RPMI 1640 培养基  	Gibco	11875093	添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素
Foundation B 胎牛血清  	Gemini	900208
1× 磷酸盐缓冲液（PBS） 	Corning	 21-040-CM
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 	Gibco	 25300-062
青霉素-链霉素  	Gibco	15140122
结晶紫  	Sigma-Aldrich	C0775
10% 甲醛溶液  	Sigma-Aldrich	HT501128