基于 ADI 的前列腺癌细胞自噬诱导：一种用于检测细胞自噬反应的酶学技术

摘要

来源：Changou, C. A. 等. 利用先进的三维荧光显微镜进行自噬的定量分析。J. Vis. Exp. (2013)

在本视频中，我们展示了基于精氨酸脱亚氨酶的自噬诱导在前列腺癌细胞中的应用。此外，可利用先进的荧光显微镜技术观察自噬诱导相关的细胞变化，包括自噬体和溶酶体的形成、分布及其融合为自噬溶酶体的过程。

方案

1. 活体成像前的细胞准备

1. 在含有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的RPMI培养基中，将表达绿色荧光蛋白偶联的轻链3（LC3-GFP）的CWR22Rv1细胞接种于35 mm多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中进行培养。细胞接种密度应足够高以促进快速增殖，但不可过高，以免在成像时细胞过度生长并聚集成团。
2. 用含ADI（0.3 μg/mL）的PBS处理选定的细胞样本。
3. 成像前约1小时，将1.5 μl LysoTracker Red DND-99（Invitrogen, CA）溶于20 mL含10% FBS和1%抗生素的RPMI培养基中。对于选定样本，使用含有ADI的溶液。在加入培养皿前，将所有培养基预热至37 °C。
4. 将细胞在含LysoTracker Red DND-99的RPMI培养基中于37 °C孵育15–45分钟。
5. 成像前约30分钟，开启WeatherStation环境控制箱，并调节至37 °C、5% CO₂（使用加湿空气）并使其达到平衡。
6. 用PBS洗涤细胞，更换为仅含10% FBS和1%抗生素的标准RPMI培养基。根据需要向样本中添加ADI。
7. 将35 mm玻璃底培养皿安装至定制适配器（Applied Precision, Inc., WA）中，并置于显微镜载物台上。在60倍、数值孔径1.42的物镜上使用浸油（折射率1.520），并将安装好的培养皿放置于载物台上。

2. 超分辨率结构光照明显微镜（OMX）

注意：本节中的方案适用于 OMX 结构照明显微镜（Applied Precision，WA）的操作。

1. 打开主电源及所需激光器（410 nm、488 nm 和/或 532 nm），等待 20 分钟，使激光器达到热稳定。
2. 在60倍1.42数值孔径物镜上滴加镜油（室温下固定样品用，折射率为1.516）。若油滴中出现气泡，需清洁物镜后重新添加镜油。
3. 将样本载玻片放置于载物台上，如有必要，静置10分钟使细胞沉降到盖玻片上。
4. 启动采集程序。使用荧光照明调节焦距，直至观察到清晰的细胞轮廓。
   注意： 在进行实际图像采集之前，应始终注意尽量减少细胞暴露于荧光激发光下。
5. 可采用螺旋马赛克扫描来预览样品的较大区域，以选择细胞或感兴趣区域。扫描样品或寻找目标时，建议使用较短的曝光时间（1-10毫秒）和较低的激发光功率（透射率0.1-1%）。
6. 通过GFP-LC3荧光鉴定自噬体。通过Alexa Fluor 555标记的抗LAMP（溶酶体相关膜蛋白）抗体和DAPI对溶酶体及细胞核进行鉴定（固定样品）。
7. 选择实验条件，包括激发波长、成像区域（如 512×512）、Z轴层厚、曝光时间以及激光透射百分比。对于超分辨率成像，需确保启用结构照明显微选项；在OMX系统上进行去卷积显微成像时，应选择常规照明选项。
8. 为获得最佳重建效果，应选择实验条件，使采集过程中最大强度计数保持在10,000至15,000之间。若存在光漂白问题，可采用较低曝光（计数在5,000至10,000之间）。理想情况下，整个采集过程中计数下降不应超过两倍，应避免下降超过四倍。如有必要，可减小图像层厚以维持稳定的强度计数。相机饱和值为64,000计数，因此最大强度绝不可超过此值。对于优质样品，我们发现实验条件通常为10~50毫秒曝光时间，激光透射率为1%。优先选用亮度高且光稳定性好的样品，以便重复成像。对于延时、超分辨率成像，必须使用稳定的染色方法。
9. 为减少噪声，建议采用95 MHz的读出速度（中速选项）和2毫秒或更长的采集时间。当样品在采集过程中发生移动时，重建图像中会出现更明显的伪影。因此，对于非贴壁细胞或移动较快的细胞，建议采用较短的曝光时间。
10. 多通道成像可同时或依次进行。建议采用依次成像模式，因其产生的串扰更少。
11. 为减少光漂白，通常建议先使用较长激发波长进行成像（532 nm、488 nm，然后 410 nm）。然而，对于图中所示的实验结果 图1由于该特定样品的光稳定性，此顺序被颠倒（即 48 nm、532 nm 和 410 nm）。
12. 通过移动显微镜载物台，使细胞顶部/底部略微超出焦平面，以此设定Z轴层扫的上限/下限。为实现超分辨率成像，各图像间的理想间距应恒定为0.125 μm，因为重建软件默认采用该数值。
13. 使用 SoftWorX（Applied Precision，WA）重建图像堆栈，并使用 VoloCITY 6.0（Perkin Elmer，MA）进行分析。

结果

图1. 细胞内自噬体与溶酶体的分布。 A. 上图） DV模式（模拟宽场去卷积，左侧）与OMX显微镜结构照明显微模式（右侧）获取并重建的图像并列比较。比例尺表示5 μm。 B. 下图） 自噬体与溶酶体的小范围共定位（箭头所示）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
精氨酸脱亚氨酶（ADI）	DesigneRx
HEPES	Sigma	H4034
酪蛋白	Sigma	C5890
多聚甲醛	Fisher	4042
皂苷	Sigma	S4521
Alexa 抗小鼠 555	Invitrogen	A21422
Alexa 抗兔 647	Invitrogen	A21244
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
抗 Lamp1 抗体	DSHB	H4A3
抗钙黏蛋白抗体	Cell Signaling	#3195
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936
35 mm 聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿	MatTek	P35GC-1.5-1.4-C
1 号，22 mm 盖玻片	Corning	#2865-22
显微镜载玻片	Globe Scientific	1324G